التمايز الماكروفياج والاستقطاب إلى النمط الظاهري M2 مثل باستخدام الإنسان Monocyte مثل THP-1 خط خلايا سرطان الدم
أغسطس 2, 2021
ترتبط الضامة المرتبطة بالورم (TAM) الشبيهة ب M2 بتطور الورم وضعف التكهن في السرطان. يعمل هذا البروتوكول كدليل مفصل للتمييز والاستقطاب بشكل مستنسخ بين الخلايا الشبيهة بخلايا THP-1 الأحادية في الضامة الشبيهة ب M2 في غضون 14 يوما. هذا النموذج هو الأساس للتحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من تام داخل البيئة الدقيقة الورم.
ترتبط الضامة المرتبطة بالورم المضاد للالتهابات بالتقدم وسوء التكهن في السرطان. هذا البروتوكول هو دليل لتمييز واستقطاب THP-1 الخلايا الأحادية مثل في الضامة M2 مثل في غضون 14 يوما. حاليا لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب THP-1 المضاد للالتهابات.
يستخدم هذا البروتوكول فترات الراحة الكافية وعملية استقطاب مطولة لإنشاء نوع فرعي ماكروفيج مميز يشبه M2. تطوير الورم ، على سبيل المثال ، في سرطان القولون وإعادة عرض الأنسجة ، يتم التحكم فيه عن طريق الضامة المضادة للالتهابات. ومن بين الدراسات التي تحقق في وظيفتها، يضمن الإنشاء الموحد لنوع فرعي متميز يشبه M2 النتائج القابلة للاستنساخ.
ابدأ بتعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-1 من النيتروجين السائل وتذوب القارورة على الفور في 37 درجة مئوية في حمام مياه نظيفة، بدءا من جهاز ضبط الوقت بمجرد وضع القارورة في حمام الماء. تخفيف الغطاء لإطلاق الضغط الذي تراكم بسبب عملية الذوبان ، وضمان عدم اتصال فتحة الأنبوب بالماء لتجنب التلوث.
إذابة تعليق الخلية حتى يتم ترك رقاقة الجليد حوالي أربعة ملليمترات في الحجم داخل القارورة والمضي قدما إلى الخطوة التالية على الفور. نقل المرحلة السائلة من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلتر من وسائل الإعلام النمو الدافئ. ثم نقل ملليلتر واحد من هذا التعليق الحار للخلايا المتوسطة في قارورة THP-1 والعودة إلى أنبوب 15 ملليلتر لإذابة رقاقة الثلج المتبقية، وتدفق القارورة لضمان عدم ترك أي خلايا وراءها.
خلط تعليق بلطف عن طريق ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة ملليلتر واحد. إزالة ما يقرب من 10 ميكرولتر من العينة لحساب الخلايا لقابلية البقاء باستخدام الأزرق تريبان. الخلايا مع السيتوبلازم واضحة قابلة للحياة، والسيتوبلازم الأزرق يشير إلى موت الخلية.
أثناء العد، قم بتدليس تعليق الخلية الدافئة بمعدل 200 مرة G لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية. إزالة supernatant تماما وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط النمو لتحقيق كثافة الخلية من 500،000 خلية لكل ملليلتر. اخلط التعليق برفق ونقل 22 ملليلتر إلى قوارير ثقافة الخلية T75 لكل منها.
تخزين قوارير تستقيم في حاضنة في 37 درجة مئوية مع تركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪وتبادل وسائل الإعلام النمو كل ثلاثة إلى أربعة أيام. إعداد تعليق الخلية لزرع الخلايا بكثافة 300، 000 لكل ملليلتر لكل بئر في لوحات ثقافة الخلايا 24 جيدا. مزيج متوسط بلطف وإعداد aliquots من 26 ملليلتر في أنابيب 50 ملليلتر.
نقل ملليلتر واحد من الوسط المحتوي على الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. اخلط الوسائط برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بين التحويلات. الحفاظ على حل العمل الطازجة من PMA على الجليد وإضافة 100 نانوغرام من PMA لكل بئر.
احتضان الأطباق في الحاضنة دون أي علاج آخر لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة، قم بإزالة وسيط النمو واستبدله بميليلتر واحد من متوسط النمو الطازج، مع ضمان عدم لمس الجزء السفلي من الآبار بنصائح ماصة. دع الخلايا ترتاح لمدة 96 ساعة أخرى في الحاضنة.
إزالة متوسط النمو واستبداله مع ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج. إضافة 20 نانوغرام من إنترلوكين 4 و 20 نانوغرام من إنترلوكين 13 لكل بئر. ثم دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
كرر العملية بأكملها بعد 48 ساعة والسماح للخلايا بالراحة لمدة 48 ساعة أخرى في الحاضنة. إزالة متوسط النمو واستبداله مع ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج. ثم دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
إزالة المتوسطة الخلية الدافئة من كل بئر واستبداله مع خليط ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم و 5٪ FBS. ثم ضع لوحة الخلية على الجليد على الفور لمدة 45 دقيقة. بعد 45 دقيقة على الجليد، كشط قبالة الخلايا باستخدام كاشطات الخلايا الصغيرة.
نقل بلطف الضامة منفصلة إلى برنامج تلفزيوني الباردة و 5٪ FBS في أنبوب 15 ملليلتر أبقى على الجليد. تظهر الضامة المشتقة من أسلوب الاستقطاب التعبير عن CD14، وكذلك علامات CD11b. تم التعبير عن علامات monocyte و macrophage CD14 و CD11b في 70.9٪ و 74.7٪ من الخلايا، على التوالي.
وأظهرت الخلايا مستويات سطحية منخفضة من CD80 علامة M1 مثل في 0.2٪ من الخلايا، ومستويات سطح عالية من CD206 علامة تشبه M2 في 62.6٪ من الخلايا. كما THP-1 الخلايا في المتوسط تميل إلى الغرق إلى الجزء السفلي من قارورة وسهلة التنشيط من خلال الإجهاد الميكانيكي، خلط لطيف والتعامل مع الخلايا مهم. يتم إنشاء الضامة M2 مثل بشكل مستنسخ، وقد تم وصفها باستخدام QR-TPCR، ELISA، وتدفق قياس الخلايا.
هذا هو الأساس للتحقيق في الآليات المضادة للالتهابات في تطور السرطان أو إعادة عرض الأنسجة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يوفر هذا البروتوكول دليلاً شاملاً لتمييز وتقطيب الخلايا الشبيهة بالوحيدات THP-1 إلى خلايا ماكروفاجية شبيهة بـ M2 خلال 14 يومًا. ترتبط الخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2 المرتبطة بالورم (TAM) بالتقدم السرطاني والتشخيص السيئ في السرطان، مما يجعل هذا النموذج ضروريًا لدراسة تأثيراتها المضادة للالتهابات في بيئة الورم المكروية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث السرطان
الخلفية
- ترتبط الخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2 بتقدم السرطان.
- هناك نقص في النماذج المثبتة لتقطيب THP-1 المضاد للالتهابات.
- إن الإنشاء المعياري لأنواع مختلفة من الخلايا الماكروفاجية أمر بالغ الأهمية للبحوث القابلة للتكرار.
- تلعب الخلايا الماكروفاجية المضادة للالتهابات دورًا في تطور الورم وإعادة تشكيل الأنسجة.
هدف الدراسة
- لتوفير بروتوكول قابل للتكرار لتوليد الخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2.
- للتحقيق في دور TAM في بيئة الورم المكروية.
- لتعزيز فهم الآليات المضادة للالتهابات في السرطان.
الطرق المستخدمة
- تمايز الخلايا الشبيهة بالوحيدات THP-1 إلى الخلايا الماكروفاجية.
- عملية تقطيب مطولة لتحقيق النمط الظاهري الشبيه بـ M2.
- إدراج فترات راحة خلال البروتوكول.
- معايرة الطرق لضمان القابلية للتكرار.
النتائج الرئيسية
- تمايز وتقطيب ناجح للخلايا THP-1 إلى الخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2.
- تأسيس نموذج موثوق لدراسة وظائف TAM.
- رؤى حول الأدوار المضادة للالتهابات للخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2 في السرطان.
- الآثار المحتملة للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف TAM.
الخلاصات
- يمكن البروتوكول من التوليد القابل للتكرار للخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2.
- يمكن فهم وظائف TAM أن يلهم نهج علاج السرطان.
- تحتاج البحوث الإضافية لاستكشاف الإمكانيات العلاجية لاستهداف الخلايا الماكروفاجية الشبيهة بـ M2.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical gap in immuno-oncology research by providing a standardized method to generate M2-like tumor-associated macrophages from THP-1 cells, enabling reproducible investigation of immunosuppressive mechanisms in cancer. The model supports target validation and mechanistic de-risking for therapies aimed at modulating macrophage polarization in the tumor microenvironment. By establishing a reliable M2-like phenotype, it enhances predictive confidence in preclinical studies linking TAM function to tumor progression and tissue remodeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of M2-like macrophage phenotype as a therapeutic target in cancer progression.
- Operational Value: Provides a consistent cellular model for validating targets involved in macrophage polarization pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized macrophage population for screening immunomodulatory compounds affecting M2 marker expression.
- Operational Value: Supports assay development with defined endpoints such as CD206 and CD80 expression levels for compound profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates preclinical evaluation of agents that modulate TAM polarization in tumor-like contexts.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of M2-like macrophage stability and function over the 14-day polarization timeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying a validated macrophage model for target engagement and functional screening prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on M2-polarizing signals and their role in tumor-promoting inflammation.
- Screening: Delivers reproducible macrophage preparations for quantitative assessment of compound effects on polarization markers.
- Analytics: Enables flow cytometry, qRT-PCR, and ELISA readouts to measure CD206, CD80, CD14, and CD11b as polarization indicators.
- Translational Research: Models M2-like TAM involvement in tumor progression and tissue remodeling for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immunology and oncology teams studying macrophage-mediated drug resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in TAM-related phenotypes through standardized M2-like macrophage generation.
- Operational Value: Ensures reproducibility across laboratories via defined differentiation, resting, and polarization intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable preclinical data on macrophage-targeted interventions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on consistent M2-like macrophage responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, flow cytometry, and cytokine handling.
- Depends on access to incubators, biosafety cabinets, and equipment for cell counting and viability assessment.
- Necessitates standardization of PMA, IL-4, and IL-13 dosing and timing across users.
- Involves adaptation considerations when translating findings to primary human monocytes or in vivo models.
- Includes practical limitations such as donor variability in primary cells and the need for aseptic technique during extended culture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:56
Culturing and Maintenance of THP‐1 Monocyte-like Cells
2:59
Seeding of THP‐1 cells and Differentiation into M0 Macrophages
4:01
Polarization of M0 Macrophages into M2‐like Macrophages
4:39
Detaching and Harvesting Macrophages for Flow Cytometry
5:14
Results: Macrophage Differentiation and Polarization into an M2‐Like Phenotype
5:56
Conclusion
