طريقة فعالة لتوجيه الخلايا الكبدية مثل التعريفي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).

الخلايا الجذعية الجذعية البشرية المشتقة من خلايا الكبد مفيدة في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هذه طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بشكل فعال إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد. حالة غير متمايزة والتقاء مناسب من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حاسمة للتمايز الناجح للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية.

للحفاظ على الخلايا الجذعية، معطف العقيمة ستة آبار لوحات الأنسجة المعالجة مع ملليلتر واحد من 1X الإنسان الجنينية الخلايا الجذعية المؤهلة Matrigel لكل بئر، وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اتركي الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. إذابة HESEs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق دون اهتزاز، ثم نقل الخلايا الجذعية على الفور عن طريق الأنابيب لهم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليلتر من قبل الحارة، 37 درجة مئوية mTESR المتوسطة.

طرد مركزي HESEs و يستنشق supernatant، ثم بلطف إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسط mTESR. يستنشق المتوسط DMEM F-12 من لوحة. بذور الخلايا في لوحة من ستة آبار في كثافة 1 × 10 إلى الخلايا 5 في اثنين من ملليلتر من mTESR، واحتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.

الحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال المتوسط مع mTESR مسخن المتوسطة يوميا. مرور الخلايا في ما يقرب من 70 إلى 80٪ التقاء، أو عندما تبدأ مستعمرات الخلية لإجراء اتصال. بالنسبة للخلايا التي تمرر ، يستنشق الوسط ويحتضن الخلايا بميليلتر واحد لكل بئر من محلول الإنزيم لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

نقل الخلايا عن طريق الأنابيب لهم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليلتر من DMEM F-12 مسبقا إلى 37 درجة مئوية. إعداد لوحات 24 جيدا عن طريق طلاء لهم مع 250 ميكرولتر من 1X hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة. البذور hESCs في كثافة 1-1.5 مرات 10 إلى الخلايا 5 لكل بئر في 500 ميكرولتر من المتوسط mTESR.

إضافة كل من أكتيفين ألف إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر وCHIR99021 إلى تركيز نهائي من ثلاثة ميكرومولار في حجم مناسب من المرحلة المحمى مسبقا وسيطة التمايز الأساسية. بعد ثلاثة أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات خلايا إندوديرم نهائية، مثل FOXA2 و SOX17 و GATA4 و CXCR4 و FOXA1. في اليوم الثالث من التمايز، يستنشق الوسط، يستبدل بالمرحلة الثانية المتوسطة، ويحتضن لمدة 24 ساعة.

تغيير المتوسطة كل يومين في الأيام من أربعة إلى ثمانية. بعد ثمانية أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن العلامات المناسبة لخلايا السلف الكبدية، مثل HNF4 ألفا، AFP، TBX3، TTR، ALB، NTCP، CEBPA. في اليوم الثامن، يستنشق المرحلة الثانية المتوسطة من الخلايا، واستبدالها بالمرحلة الثالثة المتوسطة.

السماح للخلايا باحتضان لمدة 10 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ، وتغيير الوسائط كل يومين مع عوامل التمايز المضافة حديثا. بعد 18 يوما من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات مميزة للخلايا الكبدية، مثل AAT، ALB، TTR، HNF4 ألفا، NTCP، ASGR1، CYP3A4. يتم عرض الرسم التخطيطي للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية من hESCs والصور الميدانية الساطعة لكل مرحلة تمايز.

في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة ثلاثة أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجها بوسط تمايز لمدة خمسة أيام. في المرحلة الثالثة ، بعد 10 أيام ، نضجت خلايا الكبد المبكرة وتباينت إلى خلايا تشبه خلايا الكبد في عامل نمو خلايا الكبد والأونكوستاتين.

في المرحلة النهائية من التمايز، أظهرت الخلايا النمط الظاهري الكبدي النموذجي. تم استخدام RT-PCR، وتلطيخ المناعة، والنشاف الغربي للكشف عن علامات خلايا الإندوديرم، وخلايا السلائف الكبدية، والخلايا الكبدية الناضجة. وأظهرت الخلايا المتمايزة مستويات عالية من التعبير عن الجينات والبروتينات ذات الصلة بالتمايز في كل مرحلة، مثل علامات endoderm SOX17 في اليوم الثالث، وعلامة السلائف الكبدية HNF4 ألفا في اليوم الثامن، ووكالة الصحافة الفرنسية في اليوم 14، وعلامة خلايا الكبد الناضجة ALB في اليوم 18.

أظهرت HLCs تلطيخ أخضر وتلطيخ واسع النطاق لحمض السيتوبلازميك. وأظهرت خلايا الكبد مورفولوجيا ثنائية النواة نموذجية. تم تأكيد النشاط الأنزيمي ل CYP3A4 ، وهو CYP الأيضي الأساسي في الكبد في HLCs ، مع فحص إنزيم.

إن وضع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بكثافة مناسبة وبدء التمايز في التاريخ التالي أمران حاسمان. في المرحلة الأولى، المس الوسائط برفق لأن الخلايا عرضة للطفو. مزيج من activin A والجزيئات الصغيرة الأخرى قد تزيد من تحسين كفاءة التمايز، وإنتاج خلايا أكثر نضجا مثل خلايا الكبد في هذا الإجراء.

يمكن أن توفر هذه التقنية منصة لاستكشاف زرع خلايا الكبد وهندسة أنسجة الكبد والكبد الاصطناعي الحيوي ونمذجة الأمراض.