تصور تشكيل غشاء الكشكشة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. يوفر SEM صورا عالية الدقة لسطح الخلية يمكن استخدامها لتصور أنشطة غشاء الخلايا الكبيرة. يمكن استخدام هذه التقنية لاكتشاف مسارات إشارات جديدة تنظم ندرة الخلايا الكبيرة ، وتحديد محفزات ومثبطات جديدة لندرة الخلايا الدقيقة.

ابدأ بوضع أغطية زجاجية معقمة في آبار صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. ثم تنزلق 264.7 بلاعم خام على الغطاء بكثافة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر وتحتضن الصفيحة بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط في كل بئر ب 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة الجديدة ، ثم عالج البلاعم مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام عنصر تحكم في السيارة مثل DMSO أو مثبط كثرة الخلايا الكبيرة مثل EIPA.

بعد ذلك ، لتعزيز كشكش الغشاء ، عالج الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام محفزات زيادة العظم ، مثل محلول PMA ميكرومولاري واحد أو 100 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم. لإصلاح الخلايا للفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، قم بشفط الوسائط من الآبار واغسل الغطاء مرتين باستخدام PBS البارد ، ثم احتضن انزلاقات الغطاء في مثبت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها حضانة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، دون إزعاج الطبقة الأحادية للخلية ، اغسل بلطف ثم احتضن الغطاء في 500 ميكرولتر من كاكوديلات الصوديوم بمحرك 0.1 لمدة 15 دقيقة.

بعد غسلتين مع 500 ميكرولتر من الماء المقطر ، اغسل الغطاء مرتين في 500 ميكرولتر من سلسلة الإيثانول المتدرجة مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة. لإجراء تجفيف النقاط الحرجة ، ضع انزلاقات الغطاء في مجفف نقطة حرجة وقم بتغطيتها بالإيثانول بنسبة 100٪. ثم اضغط على زر الطاقة وافتح خزان ثاني أكسيد الكربون.

اضغط على زر التبريد لمدة 30 ثانية تقريبا حتى تنخفض درجة الحرارة إلى الصفر درجة مئوية. ثم اضغط على زر التعبئة حتى تظهر فقاعة في نافذة الغرفة. بعد ذلك ، اضغط على زر التطهير حتى تختفي رائحة الإيثانول من عادم التطهير.

ثم اضغط على زر التبريد مرة أخرى حتى تنخفض درجة الحرارة إلى الصفر درجة مئوية. أعد الضغط على الأزرار الكاملة والتطهير لإيقاف تشغيلها. ثم أغلق خزان ثاني أكسيد الكربون.

أعد الضغط على الجزء السفلي البارد لإيقاف تشغيله، ثم اضغط على زر الحرارة. اضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية والضغط على 1،200 رطل لكل بوصة مربعة. بمجرد استقرار الضغط ودرجة الحرارة، اضغط على زر التسييل للسماح للضغط بالانخفاض ببطء.

بمجرد أن يصل ضغط الغرفة إلى 150 رطلا لكل بوصة مربعة ، اضغط على قاع فتحة التهوية وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى صفر رطل لكل بوصة مربعة. أوقف تشغيل مجفف النقاط الحرجة وأزل انزلاقات الغطاء. بعد ذلك ، باستخدام صنابير لاصقة كربونية ، قم بتركيب زلات الغطاء على حوامل عينات الألومنيوم للمسح المجهري الإلكتروني ، ثم انتقل إلى طلاء الرذاذ باستخدام الذهب أو البلاديوم في معطف التناثر.

قم بتشغيل زر الطاقة الخاص بطبقة المعطف اللسف. بعد أن يصل الفراغ إلى 30 ملليتور، اغسل الغرفة لإزالة الرطوبة والهواء عن طريق إيقاف تشغيل مفتاح الغاز وتحويل صمام الغاز الدقيق عكس اتجاه عقارب الساعة. بمجرد زيادة الفراغ إلى 200 مللي تورس ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الغاز وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 مللي تور.

ثم اغسل الغرفة مرة أخرى لإزالة الرطوبة والهواء كما هو موضح. بعد تنظيف الغرفة ثلاث مرات ، ادفع الجزء السفلي من المؤقت واضبط مقبض الجهد حتى يقرأ المقياس 10 مللي أمبير. ثم ، قم بإزالة زلات الغطاء المطلي من الغرفة.

لتصور الكشكشة الغشائية وقياسها كميا، أدخل انزلاقات غطاء العينة في حجرة المجهر الإلكتروني الماسح، وأغلق الباب، واضغط على زر الإخلاء. افتح برنامج تشغيل المجهر واضبط الجهد المتسارع على 15 كيلوفولت ومسافة العمل على 10 ملم. اضغط على زر الإحداثيات وتحرك حول وحدة التحكم حتى تظهر الخلايا في وسط شاشة الملاحظة.

اضبط التكبير على 3،500 X وصور العينة بالنقر فوق الزر صورة. تظهر هنا صور تمثيلية للمجهر الإلكتروني الماسح الضوئي ، توضح تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم الخام 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم. المعالجة المسبقة للبلاعم مع مثبط كثرة العظم EIPA تخفف من تكوين كشكشة الغشاء.

أثناء تكوين الكشكشة ، يمر غشاء البلازما بمراحل مورفولوجية متميزة ، بما في ذلك نتوء غشاء يشبه الورقة ، وكشكشة غشاء على شكل حرف C ، وكوب كبير. يمكن تحديد تكوين كشكشة الغشاء بعد PMA ومعالجات العوامل المحفزة لمستعمرة البلاعم باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، في حين يمكن تأكيد تكوين macropinosome بواسطة تقنيات التصوير البديلة ، مثل المجهر البؤري باستخدام تكساس ريد ديكستران و FM4-64. تشير الأسهم الزرقاء إلى كشكش الغشاء ، بينما تشير الأسهم الصفراء والخضراء إلى micropinosomes.

وأخيرا، يمكن تأكيد ندرة الخلايا الكبيرة وقياسها كميا من خلال قياس التدفق الخلوي باستخدام علامة طور سائل الفلورسنت مثل FITC أو تكساس ريد ديكستان. بالإضافة إلى SEM ، يمكن أيضا إجراء تصوير الخلايا الحية وتحليل قياس التدفق الخلوي لاستيعاب الدكستران المسمى بالفلورسنت للتحقيق في ندرة الخلايا الكبيرة وقياسها كميا.