تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية والخالدة

يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم سمية تركيبات منتجات العيون الجديدة في المختبر. من خلال تحسين تركيزات المواد الكيميائية وتركيبات المنتجات باستخدام خلايا العين في المختبر ، يمكن تقليل استخدام الحيوانات لتقييم سلامة المنتجات الجديدة. تقيم المقايسات في المختبر نقاط نهاية السمية التي لا يمكن تقييمها في الجسم الحي ، مثل تحديد تأثير مادة كيميائية على وظيفة الميتوكوندريا وسلامة غشاء الخلية ونشاط الإنزيم.

تقييم سمية الخلايا في المختبر هو المفتاح لفهم الآليات المحتملة للسمية. هذا ضروري لتحديد جرعة قصوى مقبولة من المواد الكيميائية العلاجية في العين. سيوضح الإجراء نيجاني ناجارودوماران ، باحث من مختبر جونز.

ابدأ بجلوس كل من pHCECs و iHCECs على أطباق بتري المطلية بالكولاجين مع انزلاقات الغطاء السفلي الزجاجي بتركيز 1 × 10 إلى 5 مع 1 ملليلتر من وسط ظهارة العين البشرية ، أو HOEM. تنمو pHCECs و iHCECs 1 مجموعة من الثقافات لمدة 24 ساعة ومجموعة أخرى لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على 4 ميكرومولار كالسيين ، و 8 ميكرومولار إيثيديوم هوموديمر 1 ، وملحق 5 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد تلطيخ الخلايا ، اضبط مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لالتقاط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. الحصول على الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد باتباع التعليمات الواردة في المخطوطة. قم بزرع الخلايا عند 5 × 10 إلى 4 لكل مليلتر من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات.

بعد الحضانة ، قلل حجم الوسط في الآبار إلى 300 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتعريض الخلايا لإشعاع UVA عند 6.48 واط لكل متر مربع ، وإشعاع UVB عند 1.82 واط لكل متر مربع عند 37 درجة مئوية لمدة 5 و 20 دقيقة في تجارب منفصلة. بعد الأشعة فوق البنفسجية ، أضف 200 ميكرولتر من HOEM الطازج إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، اجمع طاف الخلية في كل بئر وانقله إلى أنابيب البولي بروبلين المعقمة سعة 2 ملليلتر. قم بتجميد المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتحديد مستويات السيتوكين التي تطلقها pHCECs و iHCECs بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد واتبع تعليمات المجموعة لتحديد كمية الإنترلوكين 6 والإنترلوكين 8 والإنترلوكين -1 بيتا و TNF-alpha.

تحضير كاشف فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ في DMEM و F12. استبدل وسط الاستزراع في كل بئر ب 1 ملليلتر من محلول الفحص الأيضي بنسبة 10٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 ساعات. قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند إثارة 530 نانومتر وأطوال موجية انبعاث 590 نانومتر.

خلايا البذور في 5 × 10 إلى الرابع لكل ملليلتر من HOEM في كل بئر من لوحة استزراع مطلية بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 ملليلتر من السموم الكيميائية ، والتي تشمل 0.001٪ كلوريد البنزالكونيوم ، أو BAK ، و 0.01٪ بيروكسيد الهيدروجين ، و 0.0025٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم في برنامج تلفزيوني لمدة 5 و 15 دقيقة.

بعد التعرض للسموم الكيميائية ، قم بإزالة السموم من الآبار ، واشطفها ب 1 ملليلتر من PBS ، وأضف 1 ملليلتر من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بإجراء فحص التمثيل الغذائي عن طريق استبدال الوسط ب 1 ملليلتر من محلول فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ والحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 4 ساعات. قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند إثارة 530 نانومتر ، وأطوال موجية انبعاث 590 نانومتر.

نقل طافات الخلايا من الآبار بعد الحضانة لمدة 20 ساعة إلى أنابيب البولي بروبلين المعقمة المنفصلة سعة 2 ملليلتر وتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم نفس منصة تعدد الإرسال المستخدمة لتقييم السيتوكينات من الخلايا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باتباع تعليمات المجموعة لتحديد كمية الإنترلوكين 6 والإنترلوكين 8 والإنترلوكين -1 بيتا و TNF-alpha. خلايا البذور عند 1 × 10 إلى 5 لكل مليلتر من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مطلية بالكولاجين 1 مكونة من 24 بئرا وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 ملليلتر من السموم الكيميائية ، بما في ذلك 0.001٪ BAK و 0.005٪ BAK و 0.01٪ BAK في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. بعد التعرض ، قم بإزالة السموم الكيميائية ، وشطف الآبار مع 1 ملليلتر من PBS وإضافة 1 ملليلتر من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين والإيثيديوم هوموديمير والملحق 5 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

اضبط المجهر لقياس الشدة عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث من 630 و 675 نانومتر للملحق 5 و 495 و 515 نانومتر للكالسيين AM ، و 528 و 617 نانومتر لتلطيخ الإيثيديوم 1. ثم الحصول على صور للخلايا باستخدام المجهر الفلوري. تم العثور على iHCECs لتكون خلايا صغيرة تتراوح من 10 إلى 20 ميكرومتر وكانت pHCECs في حدود 20 إلى 50 ميكرومتر بعد 24 ساعة من النمو.

لوحظت اختلافات مماثلة في نطاق الحجم ل iHCECs و pHCECs بعد 48 ساعة من النمو. بالمقارنة مع الخلايا غير المعرضة للأشعة فوق البنفسجية ، انخفض النشاط الأيضي ل pHCECs المشععة بشكل كبير في 20 دقيقة من التعرض. بالنسبة ل iHCECs ، انخفض النشاط الأيضي للخلايا المشععة في كل من 5 و 20 دقيقة.

لذلك ، استغرق الأمر وقتا أطول للتعرض لتقليل النشاط الأيضي ل pHCECs من iHCECs. كان الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين بواسطة iHCECs عند 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية. حدث الحد الأقصى لإطلاق السيتوكين ل pHCECs في 20 دقيقة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

من حيث الكميات الإجمالية من السيتوكينات الالتهابية التي تم إطلاقها ، أطلقت pHCECs عددا أكبر بكثير من إنترلوكين -1 بيتا وإنترلوكين 8 و TNF-alpha من iHCECs ، في حين أطلقت iHCECs المزيد من الإنترلوكين 6. أظهرت كل من pHCECs و iHCECs تغيرا في إطلاق الإنترلوكين 6 بعد التعرض لجميع المواد الكيميائية الثلاث. تسبب BAK في انخفاض في إطلاق الإنترلوكين 6 مقارنة بالتحكم لكل من HCECs الأولية والخالدة.

تسبب بيروكسيد الهيدروجين في زيادة إطلاق الإنترلوكين 6 من iHCECs ، وانخفاض في الإطلاق من pHCECs. تضررت كل من pHCECs و iHCECs بشكل كبير عند 0.005٪ و 0.1٪ من BAK. بعد إجراء تقييمات في المختبر لسمية خلايا العين ، يمكن إجراء المزيد من النماذج الحيوانية لسمية العين لتحديد تأثير منتج العين على أعصاب القرنية أو الجهاز المناعي للعين.

هذه التقنيات ضرورية لتحديد آليات السمية الكيميائية وصياغة المنتج على العين وستساعد في تقليل استخدام الحيوانات لاختبار تطوير المنتج.