الهجرة النووية في كريات الدم البيضاء Drosophila
مايو 13, 2021
في Drosophila، تخضع نواة البويضات لهجرة تعتمد على الميكروتبول أثناء تكوين الخلايا. هنا، ونحن نصف البروتوكول الذي تم تطويره لمتابعة الهجرة من خلال إجراء التصوير الحي على غرف البيض السابق فيفو. يحافظ إجراءنا على غرف البيض على قيد الحياة لمدة 12 ساعة للحصول على أفلام متعددة المواقع ثلاثية الأبعاد بفاصل زمني باستخدام المجهر confocal القرص الغزل.
هذه التقنية تجعل من الممكن مراقبة العمليات البيولوجية الطويلة في غرف بيض دروسوفيلا المتشرذم ، مثل الهجرة النووية البويضات ، باستخدام المجهر التصوير الحي. يصف هذا البروتوكول كيفية الحفاظ على غرف البيض المتشريح على قيد الحياة لمدة 12 ساعة لإجراء المجهر التصوير الحي. للبدء، ماصة 200 ميكرولتر من شنايدر المتوسطة وتكملة مع 30 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر الأنسولين، ثم إضافة أربعة ميكرولترات من الحرارة المعطل مصل العجل الجنين.
استخدام طرف ماصة لتطبيق كمية صغيرة من الشحوم السيليكون في جميع أنحاء حفرة على الجانب السفلي من الشريحة ثقب. ضع غطاء، واستخدم الطرف العريض من طرف ماصة للضغط على غطاء الغطاء لتسطيح شحوم السيليكون لإنشاء حلقة سيليكون داخلية على الشريحة. نقل الذباب الأنثوي المخدر إلى بئر التشريح الذي يحتوي على 150 ميكرولتر من وسيط التصوير.
لتشريح الأنثى، استخدم ملقط للاستيلاء على الصدر وقرصة كفاح البطن الظهري مع زوج ثان من ملقط. إزالة الرحم، أوفيدوكت، وغمد العضلات بعناية. عزل وفصل زوج من المبيضين مرئية على فتحة لطيف.
ضع قطرة من 10 إلى 15 ميكرولتر من وسيط التصوير على المبيضين، ونقل مبيض واحد إلى غرفة التصوير. لفصل المبيضين، استخدم الإبرة لعقد النهاية الخلفية للمبيض. استخدام إبرة أخرى لسحب بعناية الجرثومة لإغاظة ovarioles وبصرف النظر.
عقد غمد مع إبرة واحدة وسحب ovariole من خلال غرف أكبر مع إبرة أخرى لإزالة غمد العضلات المتبقية على غرف البيض. السماح للovariole غير المورثة تغرق والاتصال coverlip. إزالة المراحل المتأخرة وبقية المبيضين من غرفة النوم الدقيقة باستخدام ملقط.
استخدام الإبر لمسافة بعناية ovarioles لتسهيل عملية الاستحواذ. قطع صغيرة 10 في 10 ملليمتر مربع من الغشاء نفاذية. تطبيق بعناية الغشاء على الجزء العلوي من وسيلة التصوير لطرد أي فقاعات الهواء.
ثم ختم بإحكام الغرفة مع طبقة رقيقة من زيت الهالوكربون حول البئر على كفاف الغشاء. ضع إعداد التصوير على حامل الشريحة للمجهر المقلوب واستخدم هدف 40X. تم التقاط هجرة نواة البويضات لغرفة بيض من النوع البري باستخدام المجهر التصوير الحي.
تصل النواة إما إلى غشاء البلازما الأمامي أو غشاء البلازما الجانبي قبل الانزلاق على طول المسارات للوصول إلى موقعها النهائي عند تقاطع غشاءي البلازما. تشوهات الأغشية، والخلايا الجريبية غير المنظمة، وتوقف الخلايا، والنوى تقلصت هي العلامات الأولى لغرف البيض الموت. لا يتم الكشف عن البويضات المتحللة قبل ثماني ساعات من التصوير عادة.
ومع ذلك ، فإن الحالات النادرة من الانحطاط المبكر ترجع إلى مشاكل أثناء التشريح أو الخطوات المتصاعدة. إتلاف غرف البيض يعرض بقاءهم للخطر. تشريح دقيق اليد الدقيقة جدا وإعداد غرفة الميكروشامبر هي ذات أهمية قصوى.
سمح لنا هذا الإجراء بتصور أن نواة البويضات يمكن أن تتخذ ثلاثة مسارات مختلفة أثناء هجرتها وتنظم العضيات المختلفة هذه المسارات داخل البويضات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول طريقة لمراقبة هجرة نواة البويضة في ذبابة الفاكهة Drosophila من خلال مجهر التصوير الحي. تتيح هذه التقنية الحفاظ على غرف البيض التي تم تشريحها لمدة 12 ساعة، مما يسمح بالتقاط أفلام زمنية ثلاثية الأبعاد متعددة المواضع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا التنموية
خلفية علمية
- تُعد ذبابة الفاكهة (Drosophila) كائناً نموذجياً لدراسة عملية تكوين البويضات.
- تعد الهجرة المعتمدة على الأنيبيبات الدقيقة أمراً بالغ الأهمية لتطور البويضة.
- تعزز تقنيات التصوير الحي لفهم العمليات الخلوية الديناميكية.
- يُعد الحفاظ على حيوية حجرات البيض أمراً ضرورياً للتصوير طويل الأمد.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول للتصوير الحي لهجرة نواة البويضة.
- الحفاظ على غرف البيض حية لفترات ممتدة أثناء الملاحظة.
- استخدام مجهر confocal ذو القرص الدوار للتصوير التفصيلي.
الطرق المستخدمة
- تحضير وسط شنايدر (Schneider Medium) المدعم بالإنسولين ومصل عجل جنيني.
- تطبيق الشحم السيليكوني لإنشاء بيئة تصوير مستقرة.
- تشريح الذباب الإناث للحصول على غرف البيض لغرض التصوير.
- استخدام المجهر البؤري الدوار (spinning-disk confocal microscopy) لالتقاط مقاطع فيديو بنظام الفاصل الزمني (time-lapse).
النتائج الرئيسية
- الحفاظ الناجح على غرف البيض لمدة 12 ساعة أثناء التصوير.
- التصوير الواضح لعمليات هجرة نواة الخلية البيضية.
- إثبات فعالية تقنيات التصوير الحي.
- المساهمة في فهم علم الأحياء النمائي في Drosophila.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول الملاحظة التفصيلية لديناميكيات البويضات.
- يوفر التصوير الحي رؤى حول آليات الهجرة الخلوية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على عمليات بيولوجية أخرى في ذبابة Drosophila.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر فهم ديناميكيات الهجرة النووية في الأنظمة النموذجية مثل بويضات Drosophila رؤى أساسية حول تنظيم الهيكل الخلوي وآليات النقل داخل الخلايا ذات الصلة بالتحقق من صحة الأهداف في المقايسات القائمة على الخلايا. يتيح التصوير الحي لحركة العضيات ثلاثية الأبعاد تقليل المخاطر الميكانيكية للفرضيات التي تشمل البروتينات الحركية، أو استقرار الأنيبيبات الدقيقة، أو إنشاء القطبية—وهي اعتبارات رئيسية في مرحلة الاكتشاف المبكر حيث يعتمد الفحص المظهري على القراءات تحت الخلوية. يدعم هذا النهج الثقة التنبؤية من خلال ربط الاضطرابات الجزيئية بسلوكيات خلوية ملحوظة وقابلة للقياس في نظام ذي صلة بالمرض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بمنظمات الهيكل الخلوي وبروتينات تحديد موقع النواة من خلال التصوير المباشر لمسارات الهجرة.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال ربط الاضطرابات الجينية أو الدوائية بالتغيرات في أنماط حركة النواة ثلاثية الأبعاد.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تسهل توحيد المقاييس من خلال توفير قراءات كمية ذات دقة زمنية لموضع النواة وحركية الهجرة في بيئة تصوير محكومة وطويلة الأمد.
- القيمة التشغيلية: تعزز الجاهزية للفحص من خلال تحضير غرف متكرر ومستقر، والحفاظ على حيوية غرف بيوض Drosophila لمدة تصل إلى 12 ساعة، مما يتيح إجراء مقارنات بين ظروف متعددة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لدراسة عيوب القطبية المرتبطة بالاضطرابات النمائية، مما يدعم استكشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال ربط سوء التموضع النووي بالنتائج المظهرية.
- القيمة التشغيلية: يعزز الاستمرارية الانتقالية من خلال السماح بالتحقق من نتائج مرحلة الاكتشاف في نموذج قابل للتعديل وراثياً ومتوافق مع التصوير الحي قبل الانتقال إلى الأنظمة الثديية.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف، ومروراً بتحسين المقايسة، وصولاً إلى التحقق قبل السريري، لا سيما عندما تكون الديناميكيات النووية أو وظائف الهيكل الخلوي محورية في آلية العمل.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال التصوير المرئي لكيفية تأثير تعطيل جينات محددة أو المعالجات المركبة على الهجرة النووية في الوقت الفعلي.
- الفحص: تتيح الجاهزية للمقايسة من خلال إعداد حجرة معياري وتتبع ثلاثي الأبعاد كمي لموقع النواة كقراءة وظيفية لتأثيرات المركبات.
- التحليلات: تولد مخرجات قابلة للقياس مثل سرعة الهجرة، واختيار المسار، والتموضع النووي النهائي، والتي يمكن مقارنتها إحصائياً عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط العمل بالدراسات قبل السريرية من خلال إنشاء صلة سببية بين عيوب التموضع النووي والأنماط الظاهرية التنموية، مما يوجه قرارات التقدم المدروسة بناءً على المخاطر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة النقل داخل الخلايا، أو تموضع العضيات، أو إنشاء القطبية عبر مشاريع متعددة في بيولوجيا الخلية والتنمية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في الآليات المستهدفة من خلال تقليل الغموض في كيفية تأثير التدخلات الجزيئية على التنظيم والديناميكيات داخل الخلوية.
- القيمة التشغيلية: توفر التقييس وقابلية التكرار عبر بروتوكول مُصدق لإعداد الغرفة يحافظ على حيوية الأنسجة من أجل التصوير الحي الممتد.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير ركائز نمطية مبكرة وقابلة للملاحظة للأهداف المشاركة في تنظيم الهيكل الخلوي أو النقل داخل الخلايا.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر بناءً على تأثيرها المثبت على الهجرة النووية، وهي عملية مرتبطة بمصير الخلية وسلامة النمو.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح ذبابة الفاكهة (Drosophila)، والمجهرية التصويرية الحية، وتحضير العينات الفلورية.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى أنظمة التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) طويلة المدى ذات القرص الدوار (spinning-disk confocal) أو ما يعادلها، مع وجود تحكم بيئي.
- يستلزم توحيد معايير إغلاق الغرفة وتكوين الوسط عبر الفرق لضمان بقاء غرف البيض بشكل ثابت.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند تطبيق نظام الغرفة على أنواع أخرى من الأنسجة أو مراحل نمو أخرى تتجاوز مرحلة منتصف تكوين البويضات (mid-oogenesis).
- يقتصر بمدى الملاءمة الفسيولوجية لـ Drosophila للأمراض البشرية، مما يستدعي التحقق المتعامد في الأنظمة الثديية للأهداف الانتقالية.
