نظام O9-1/Hydrogel محسن لدراسة الإشارات الميكانيكية في خلايا كريست العصبية

تساعد الطريقة في دراسة الإشارات الميكانيكية لخلايا القمة العصبية وتفاعلها مع الإشارات الكيميائية. ويمكن أن تساعد أيضا في الآليات الجزيئية والجينية للتنمية قمة العصبية في الأمراض. نقل زلات الغطاء الزجاجي هو الأكثر تحديا وبالتالي نقلها ببطء وانتباه لمنع كسر وإسقاطها.

إثبات العملية سيكون أنا والدكتورة شيري جاو، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بوضع العدد المطلوب من الغطاء الزجاجي على قطعة من المسح المختبري. ثم تعقيم كل غطاء زلة عن طريق تمريرها ذهابا وإيابا من خلال لهب الموقد الكحول.

عندما ينزلق الغطاء يبرد، قم بتغطية زلة الغطاء عيار 12 ملليمترا بزلقة غطاء تبلغ 200 ميكرولتر تقريبا وغطاء 25 ملليمترا مع 800 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم الضرس 0.1. بعد خمس دقائق، أسبيرات هيدروكسيد الصوديوم والسماح للغطاء ينزلق إلى الهواء الجاف لمدة خمس دقائق لتشكيل فيلم حتى. بمجرد تجفيف زلات الغطاء ، أضف ما يقرب من 18 ميكرولتر من أمينوبروبيل تريثوكسيسيلين أو APTS على زلة غطاء 12 ملليمتر و 150 ميكرولتر من APTS على زلة غطاء 25 ملليمتر.

أسبيرات الوصول APTS للسماح APTS المتبقية لتجف لمدة خمس دقائق. في وقت لاحق، شطف الغطاء ينزلق ثلاث مرات عن طريق غمرها في الماء المؤين العقيم لمدة خمس دقائق في كل مرة. نقل زلات الغطاء غسلها إلى طبق بيتري الطازجة مع الجانب التفاعلي التي تواجه ما يصل.

وعلاج زلات الغطاء عن طريق نقع في ما يكفي من 0.5٪ غلوتارالدهيد لمدة 30 دقيقة. بعد قرصنة الجلوتارالدهيد، شطف الغطاء ينزلق مرة واحدة مع الماء deionized لمدة ثلاث دقائق والهواء الجاف الغطاء ينزلق مع الجانب التفاعلي حتى. لإعداد زلات الغطاء السيليكوني ، ضع العدد المتساوي من زلات الغطاء حيث ينزلق الغطاء المغلف أمينوسيلين في طبق بيتري مبطن بفيلم para.

ثم، علاج زلات غطاء 12 ملليمتر مع 40 ميكرولتر و25 ملليمتر غطاء زلات مع 150 ميكرولتر من سيلان ثنائي كلورو الميثان أو DCMS لمدة خمس دقائق. غسل الغطاء زلات مع الماء deionized العقيمة مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة قبل وضع زلات الغطاء التفاعلي الوجه على مسح المختبر. لإعداد الهيدروجيلات، ماصة أعدت حديثا محلول هلام الأكريلاميد على زلات الغطاء المغلفة أمينوسيلين المجففة.

باستخدام ملاقط منحنية، نقل فورا DCMS تعامل زلة غطاء على رأس الحل هلام مع الجانب المعالج لمس محلول هلام وبالتالي شطيرة تغيير محلول هلام بين اثنين من زلات الغطاء. بمجرد بلمرة الجل ، افصل زلة الغطاء المعالجة DCMS مع ملاقط منحنية ، تاركا الجل متصلا بزلة الغطاء المغلفة الأمينوسيلين. بعد ذلك ، اغمر زلة الغطاء عيار 12 ملليمترا مع الهيدروجيل المرفق في لوحة محددة مسبقا من 4 أو 24 بئرا مغطاة ب 500 ميكرولتر من PBS العقيم أو الماء deionized وزلة الغطاء 25 ملليمترا في لوحة من 6 آبار مغطاة بميليلترين من PBS العقيم أو الماء المنزوع الأيون لمدة 30 دقيقة.

بعد إزالة محلول الأكريلاميد الزائد، قم بتخزين الهيدروجيلات في PBS معقم أو مياه متحللة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في وقت لاحق، يستنشق برنامج تلفزيوني أو المياه deionized من لوحة البئر قبل إضافة سولفو-succinimydyl أو سولفو-SUNPAH الحل لتغطية هلام تماما. ووضع المواد الهلامية مع الحل تحت 15 واط، 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية كشفت لمدة 10 دقائق.

جمع أكبر قدر ممكن من سولفو-سانباه لكل حل ممكن عن طريق إمالة لوحة. ثم يغسل الجل مرتين إلى ثلاث مرات مع 15 ملليمولار HEPES. إضافة 15 ملليغرام لكل ملليلتر الكولاجين 1 المخفف في حمض الخليك 0.2٪ إلى كل بئر تحتوي على الهيدروجيل.

واحتضان المواد الهلامية بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، قم بإجراء الغسيل كما هو موضح في المخطوطة قبل احتضان الهيدروجيلات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل حصان بنسبة 10٪ و5٪ FBS عند 37 مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ساعتين من الحضانة، أضف 500 ميكرولتر من DMEM المعقمة المصفاة مع 10٪ FBS و 1٪ من العقديات البنسلين إلى كل بئر وتخزين المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تكون زراعة الخلية جاهزة، لوحة ما يقرب من 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة 09-1 لكل سنتيمتر مربع في المتوسط bazell. استخدام ملاقط لنقل الغطاء زلات إلى لوحة جديدة لتقليل إشارات كاذبة من الخلايا نمت مباشرة على لوحة. ثم قم بإصلاح الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق قبل علاج الخلايا ب 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة.

بعد 15 دقيقة، والمشي في الخلايا مع 250 ميكرولتر من المصل حمار 10٪. وصمة عار الخلايا لF-أكتين مع felodipine في تخفيف من 1 إلى 400 في 250 ميكرولتر من مصل حمار 10٪، تليها الحضانة مع DAPI لمدة 10 دقائق. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة دقيقتين قبل إضافة ثلاث إلى أربع قطرات من تصاعد المتوسطة إلى كل بئر.

على المجهر الفلوري، التقط صورا لثلاثة إطارات عشوائية على الأقل لكل عينة هيدروجيل تنتج قنوات فردية ومندمجة. في تقييم صلابة الهيدروجيل من خلال المجهر القوة الذرية أو AFM، كان منحدر منحنى القوة لطيف للهيدروجيلات الناعمة حيث كانت القوة المطلوبة من مسبار AFM أقل. ومع ذلك ، على الهيدروجيلات الصلبة ، كان المنحدر المتولد أكثر انحدارا.

ثم استخدمت قياسات AFM لحساب متوسط صلابة الهيدروجيلات من معامل يونغ المرن بالكيلوباسكال. ولوحظت خصائص النمو للخلايا P19 و 09-1 في كيلوباسكال واحد و 40 كيلوباسكال هيدروجيلس للتحكم وأنظمة هلام معدلة. أدت الخلايا 09-1 التي نمت على أنظمة الجل الأصلية إلى ارتفاع عدد الخلايا الميتة.

في المقابل أظهرت الخلايا 09-1 التي تزرع على أنظمة هلام تعديل نمو الخلايا صحية وتعلق كاف إلى ركيزة الهيدروجيلس مع سطح الخلية قليلا المشار إليها من قبل الحد الأدنى من الخلايا المستديرة. أظهرت خلايا P19 المطلية على كلا النظامين الهيدروجيل فائضا من الخلايا العائمة المستديرة ونقصا في ملحقات ركائز الخلايا. تم تقييم توافق خلايا القمة العصبية أو NCCs مع نظام الهيدروجيل المعدل عن طريق تلطيخ المناعة لAP-2.

ولوحظت زيادة كبيرة في التعبير AP-2 في 09-1 الخلايا مطلي على نظام الهيدروجيل المعدلة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا 09-1 مورفولوجيا مختلفة استنادا إلى هيدروجيلس صلابة منخفضة أو عالية من خلال كميات مختلفة من ألياف الإجهاد. كان التعبير المضاد للفينكولين في 09-1 الخلايا التي تزرع على هيدروجيل 40 كيلوباسكال أعلى من تلك التي تزرع على هيدروجيل كيلوباسكال واحد مما يعكس أن الخلايا التي تزرع على ركائز أكثر ليونة تشكل الحد الأدنى من مجمعات الإضافة البؤرية من الركيزة الصلبة.

وقت الانتظار المناسب أمر بالغ الأهمية لبوليمرة الهيدروجيلات كما الأكريلاميد سامة للخلايا. غمر الهيدروجيل في برنامج تلفزيوني أو المياه deionized لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان نتائج أفضل.