Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Rupert D. Smit; Thomas J. Campion III; Rachel L. Stingel; Pushti H. Shah; Jie Chen; George M. Smith

doi:10.3791/62698

استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران الوليدية باستخدام ناقل فيروسي مزدوج باستخدام جراحة الدم...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران الوليدية باستخدام ناقل فيروسي مزدوج باستخدام جراحة الدماغ والعمود الفقري المشتركة

Full Text

2,532 Views

07:27 min

June 30, 2021

DOI: 10.3791/62698-v

Rupert D. Smit¹, Thomas J. Campion III¹, Rachel L. Stingel¹, Pushti H. Shah¹, Jie Chen¹, George M. Smith¹

¹Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Lewis Katz School of Medicine,Temple University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This protocol demonstrates a novel method for applying gene therapies to specific subpopulations of neurons in neonatal rats by utilizing chemogenetic modifiers. The study investigates the contributions of these neurons to the recovery from spinal cord injury, providing insights into the effectiveness of various techniques in promoting recovery in the developing nervous system.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neurobiology
Gene Therapy

Background

Investigates neuronal subpopulations' roles in recovery post-spinal cord injury.
Focuses on neonatal rat models to understand developmental neuroscience.
Details a double viral vector technique for targeted transduction of neurons.

Purpose of Study

To develop a method for gene therapy targeting specific neuronal populations.
To enhance understanding of mechanisms driving recovery from spinal cord injuries.
To address challenges in accurately locating spinal anatomy during the procedure.

Methods Used

This study employs surgical procedures involving viral vector injections into the cortex and spinal cord.
Neonatal Sprague Dawley rats serve as the biological model for testing gene therapies.
Step-by-step instructions for viral vector injection into the corticospinal tract are provided.
Critical steps include identification of anatomical landmarks and precise surgical techniques.

Main Results

The method successfully targets and transduces neuronal subpopulations for investigative purposes.
Findings support the use of excitatory DREADDs to aid recovery after spinal cord injury.
Highlights the importance of accurate anatomical manipulation and injection methodology for effective results.

Conclusions

This innovative technique enables precise targeting of neuronal populations, crucial for studying recovery mechanisms.
Significant implications for therapeutic applications in neurological recovery and underlying injury treatments.
Supports advancing methodologies in developmental neuroscience research.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using neonatal rats?

Neonatal rats offer a model for studying developmental processes and recovery mechanisms in the central nervous system due to their neuroplasticity.

How is the gene therapy administered in this study?

Gene therapy is administered via surgical injections of viral vectors into specific regions of the brain and spinal cord, targeting key neuronal subpopulations.

What types of outcomes can this method provide?

This method can provide insights into neuronal recovery processes, effectiveness of gene therapies, and potential mechanisms of action for spinal cord injury treatment.

How can this method be adapted to other studies?

The surgical and injection techniques can be adapted for different viral vectors or targets, allowing for various experimental designs in neuroscience research.

What are key considerations in performing this protocol?

Careful anatomical identification and precision in surgical techniques are crucial to avoid damaging surrounding tissues and to ensure successful transduction.

يوضح هذا البروتوكول طريقة جديدة لتطبيق العلاجات الجينية على مجموعات فرعية من الخلايا في الفئران حديثي الولادة في سن ما بعد الولادة من 5 إلى 10 أيام عن طريق حقن معدل كيميائي وراثي تقدمي في القشرة الحركية الجسدية و Cre recombinase قابل للنقل إلى الوراء في الحبل الشوكي العنقي.

هذا هو البروتوكول الأول الذي يوضح العدوى المشتركة الناجحة للجهاز القشري الشوكي في الفئران الوليدية. يوفر مخططا دقيقا للتحقيق في كيفية مساهمة المجموعات الفرعية الفردية للخلايا في الثدييات الشابة في التعافي من إصابة الحبل الشوكي. مثل تقنيات النواقل الفيروسية المزدوجة الأخرى ، تسمح هذه الطريقة للمستخدم بتحويل مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية بدقة ، مما يسمح للباحثين بتحديد فعالية التقنيات الكيميائية الوراثية المختلفة في تعزيز التعافي.

نتوقع من الباحثين الذين ليسوا على دراية بهذه التقنية أن يكافحوا من أجل تحديد موقع تشريح العمود الفقري المناسب. ولذا فإننا نشجعك على عد الأجزاء الفقرية باستمرار في كثير من الأحيان والرجوع دائما إلى معالمك. بعد التأكد من عمق التخدير في جرو Sprague Dawley الوليدي ، حدد المنطقة التي سيتم إجراء الشق فيها عن طريق الضغط على الملقط في خط الوسط أعلى فروة الرأس ، والشعور بالخيط السهمي.

إمساك الجلد مشدودا لضمان شق نظيف ومستقيم ودقيق ، قم بعمل شق بطول سنتيمتر واحد على طول مستوى الخياطة السهمي بدءا من الخط الأول مباشرة. بعد ذلك ، حدد bregma عن طريق فحص الملقط بلطف على طول سطح الجمجمة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لخطوط الخياطة والمسافة البادئة التي يسببها الملقط الذي يمتد على طول العظام الجدارية والجبهية. الحفاظ على الفتحة عن طريق تطبيق السنانير المرجحة على جانب الاهتمام.

قم بإزالة التهاب الأعصاب باستخدام مزيج من الأطراف القطنية والمقص الدقيق لزيادة التعرض للبريجما لزيادة الدقة. تأكد من أن الدرز الإكليلي في رؤية واضحة بما يكفي لتوفير قالب تقريبي للحقن اللاحقة. باستخدام المقص الصغير ، قم بقطع جزء من ثلاثة في اثنين ملليمتر تقريبا من عظم الجمجمة الجبهي الأيسر المجاور مباشرة للبريغما.

قم بإزالة أي حطام أو سائل دماغي ودم بأطراف قطنية. لحقن الفيروس ، ضع الإبرة في مكانها وقم ببرمجة الحاقن لحقن ميكرولتر واحد بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. عند الانتهاء من الحقن ، اترك الإبرة تستقر في القشرة لمدة ثلاث دقائق.

كرر الحقن في الإحداثيات الأخرى لما مجموعه ثلاث حقن على طول القشرة فيما يتعلق بالبريغما ، وكلها على عمق 0.6 ملم. بعد الانتهاء من الحقن ، خياطة فروة الرأس ونقل الحيوان إلى طاولة العمليات الأخرى لاستئصال الصفيحة الفقرية عنق الرحم. جس قاعدة الجمجمة باستخدام الأصابع لتحديد موقع الشق.

امسك الجلد مشدودا عن طريق وضع التوتر بالإبهام والسبابة. باستخدام شفرة رقم 11 ، ابدأ الشق عند خط الوسط من واحد إلى ملليمترين خلف قاعدة الجمجمة وقم بتمديد الشق الخلفي بمقدار سنتيمتر واحد لكشف العضلة السطحية. باستخدام النقطة الحادة للشفرة ، قم بإجراء سلسلة من الجروح برفق على طول خط الوسط للعضلة السطحية لكشف تجويف العمود الفقري وعضلات العمود الفقري العميقة.

ثم استخدم زوجا من الملقط لنشر العضلات المفتوحة وتصور النافذة الجراحية. بمجرد انكشاف عضلات العمود الفقري العميقة ، أدخل المبعدات في النافذة الجراحية واسحب النافذة الجراحية إلى سبعة إلى ثمانية ملليمترات في العرض ، مما يسمح برؤية العمود الفقري دون عائق. حدد الفقرة العنقية الثانية من خلال عمليتها الشائكة البارزة التي تبرز ظهريا وتغلف عضلة كبيرة على شكل قبة.

باستخدام الحافة المسطحة لمكشطة العظام ، اكشط برفق عضلة العمود الفقري العميقة على الجانبين لتعريض الفقرات C3 إلى C7. ابدأ الإنسي وكشط أفقيا على طول الاتجاه الموازي للصفائح الفقرية لضمان التعرض المناسب ، مما يسمح بتمييز واضح للصفائح الفقرية. السيطرة على أي نزيف مع أطراف القطن.

باستخدام C2 كدليل عند حساب مستويات العمود الفقري ، قم بقص الحواف الجانبية للصفائح الغضروفية بعناية عند C6 و C7 باستخدام مقص صغير. باستخدام زوج من الملقط الناعم ، قم بإزالة الجزء المقطوع بعناية من الصفيحة لكشف الحبل الشوكي ، وتأكد من أن نافذة العمود الفقري كبيرة بما يكفي لاستيعاب موقع الحقن المطلوب. ضع الحيوان في حامل الجمجمة المجسم وضع قطعة من الشاش ملفوفة تحت جذع الحيوان لرفع أرباعه الخلفية.

قبل البدء في الحقن ، قم بتنظيف نافذة العمود الفقري من أي دم أو سائل دماغي نخاعي عن طريق وضع أطراف قطنية ومثلثات سوجي برفق على المنطقة ، مع الحرص على عدم إهانة الحبل الشوكي. علاوة على ذلك ، قم بإنشاء حاجز حول محيط النافذة عن طريق وضع قطعة صغيرة من القطن القابل للامتصاص في الأجزاء الجانبية من نافذة العمود الفقري لمنع انسداد موقع الحقن عن طريق النزيف المستمر أو تسرب السائل الدماغي النخاعي. للحقن المباشر في الحبل الشوكي، استخدم طرف إبرة حقن الزجاج لتقريب خط الوسط للحبل الشوكي عن طريق تحديد الشريان الشوكي.

بعد ذلك ، ضع الإبرة خلف الصفيحة C5 مباشرة عند خط الوسط التقريبي واستخدمها كنقطة مرجعية. ثم ، باستخدام المناور الدقيق ، حرك الإبرة أفقيا إلى اليمين بمقدار 0.3 ملم وخفض الإبرة حتى تلامس سطح الحبل الشوكي. من هذا العمق ، يغرق الإبرة.

0.6 ملليمتر في الحبل الشوكي. حقن ميكرولتر واحد من الفيروس المرتبط بالغدي الرجعي الذي يحمل جين Cre recombinase بمعدل 250 نانولتر في الدقيقة. ثم انتظر لمدة دقيقتين حتى ينتشر الفيروس في الحبل الشوكي قبل سحب الإبرة ببطء.

يظهر هنا وضع العلامات على الخلايا العصبية القشرية الشوكية من الطبقة الخامسة في القشرة الحركية لقسم إكليلي في الدماغ يعبر عن DREADDs المعتمدة على Cre mCherry المحقونة بالاشتراك مع حقن العمود الفقري المقابل ل Cre الرجعي. ستساعد القدرة على استهداف مجموعات عصبية معينة على تحديد الفروق الدقيقة التي تقود الانتعاش وتوفير المزيد من الدقة لعلاج إصابة الحبل الشوكي الأساسية في الجهاز العصبي النامي. مهدت هذه الطريقة الطريق لنا للتحقيق في جدوى استخدام DREADDs المثيرة كوسيلة لعلاج إصابة الحبل الشوكي في الفئران اليافعة.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos