الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص
August 20th, 2021
يقدم هنا بروتوكول لتوليد الأنسجة الضامة المهندسة لثقافة موازية من 48 أنسجة في لوحة متعددة الآبار مع أعمدة مزدوجة ، ومناسبة للدراسات الميكانيكية ، ونمذجة الأمراض ، وتطبيقات الفحص. البروتوكول متوافق مع الخلايا الليفية من مختلف الأعضاء والأنواع ويتجلى هنا مع الخلايا الليفية القلبية الأولية البشرية.
يسمح هذا البروتوكول لبناء الخلايا الليفية وتنظيم بيئتها الخاصة في ظل ظروف ميكانيكية محددة. هذه النتائج في الأنسجة غير المنظائرة مع صلابة والتراكيب مصفوفة مماثلة للبيئة الطبيعية للخلية. يسمح هذا الأسلوب لمقارنة ما يصل إلى 48 الشروط بالتوازي.
وهي مرنة فيما يتعلق بنوع الخلية المستخدمة وظروف الثقافة. وباستخدام عدد قليل فقط من المكونات المحددة جيدا، يمكن استنساخها بين المختبرات. من خلال تطبيق العوامل المؤيدة للورم الليفي أو الأدوية المضادة للألياف ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العمليات والعلاجات الأساسية للأمراض الليفية من أي نوع.
إثبات الإجراء سيكون أليسا ديغريف، طالبة دكتوراه من مختبرنا، وأنا. في البداية، إذابة الخلايا الليفية القلبية المحفوظة بالتبريد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين تقريبا حتى يتم ترك القارورة مع كمية صغيرة فقط من الجليد. بعد ذلك، نقل تعليق الخلية دروبوايز باستخدام ماصة المصلية ملليلتر اثنين في أنبوب الطرد المركزي العقيمة المناسبة التي تحتوي على 10 ملليلتر من المتوسط نمو الخلايا الليفية.
للحصول على أفضل استرجاع للخلايا، اشطف القارورة المبردة بميليلتر واحد من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. إعادة إنفاق الخلايا بلطف ونقلها إلى قارورة ثقافة الخلية. تجديد تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية كل يومين لمدة خمسة أيام أو حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
بعد قرصنة الوسط من الخلايا المستزرعة ، وغسل الخلايا مع ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني والطفارات ، ثم إضافة ستة ملليلترات من كاشف تفكك الخلية إلى الخلايا واحتضان حتى انفصال الخلية مرئية. تحييد النشاط الأنزيمي بإضافة ستة إلى 12 ملليلتر من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية إلى الخلايا المطرودة في كاشف ارتباط الخلية. ماصة بلطف صعودا وهبوطا أربع إلى ثماني مرات باستخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لضمان تعليق خلية واحدة ونقل الخلايا إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر جديدة.
تحقق من العائد بمساعدة عداد الخلية الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بيليه أسفل الخلايا. بعد الطرد المركزي، يستنشق الفائق، نفض الغبار عن أنبوب لطرد بيليه وإعادة تثبيت الخلايا في تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية. بعد ذلك، قم بإجهاد تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية شبكية 40 ميكرومتر، ثم استخدم عداد خلايا آلي، وقيم رقم الخلية وقابليتها للحياة عن طريق استبعاد التيار الكهربائي لضمان أرقام خلايا موثوقة قبل الشروع في الأنسجة الضامة المهندسة أو إعداد العلاج بالصدمات الكهربائية.
للتحضير ل العلاج بالصدمات الكهربائية، قم بتعديل تعليق الخلية إلى 8.9 مليون خلية لكل ملليلتر عند 20 إلى 25 درجة مئوية عن طريق إضافة تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية والحفاظ على الخلايا على الجليد. نقل جميع الأنابيب الأخرى التي تحتوي على مكونات فردية من خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية على الجليد وقبل البرد فارغة 50 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي لإعداد الخليط. ابدأ في إعداد خليط هيدروجيل ECT بإضافة المكونات الموضحة في النص إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا 50 ملليلتر لتجنب تكوين فقاعة الهواء.
أولا، ماصة حمض الكولاجين القابل للذوبان نوع I هيدروجيل في ماصة المصلية مع طرف تتحمل واسعة. ضبط محتوى الملح من محلول الكولاجين عن طريق إضافة DMEM في حين يحوم بلطف أنبوب لخلط السليم. لتحييد درجة الحموضة، أضف 0.2 هيدروكسيد الصوديوم المولي أثناء تدوير الأنبوب وتأكيد تحييد عن طريق مراقبة اللون الأحمر لمؤشر الفينول الأحمر.
ثم أضف تعليق الخلية إسقاط بينما يحوم بلطف الأنبوب. خلط تعليق عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة فقط باستخدام ماصة المصلية مع طرف تتحمل واسعة لتجنب تشكيل فقاعة وتقليل الإجهاد القص. دوامة بلطف أنبوب 10 مرات لخلط شامل.
احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خليط هيدروجيل ECT على الثلج طوال عملية الصب. الرطب طرف ماصة ملليلتر واحد في خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية، ثم توزيع 180 ميكرولتر من خليط الهيدروجيل بالتساوي في كل قالب من لوحة الصب 48 جيدا تجنب قوى القص المفرطة التي قد تؤثر على سلامة تجميع مصفوفة الكولاجين وضمان أن لوحة كاملة تنتهي في 15 إلى 20 دقيقة. تأكد من أن أشكال حلقة كاملة داخل القالب والتوزيع المتقطع لخليط العلاج بالصدمات الكهربائية سيمنع تشكيل حلقة العلاج بالصدمات الكهربائية كاملة.
تجنب الأنابيب في البئر الداخلية وتشكيل فقاعات أثناء pipetting لضمان الصب هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية موحدة لتشكيل الأنسجة متجانسة ووظيفية. ضع بعناية لوحة الصب 48 جيدا داخل حاضنة ثقافة الخلية لإعادة تشكيل خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، يبدو مثل هلام ومبهمة.
أضف 600 ميكرولتر من 37 درجة مئوية من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الدافئ لكل بئر على طول الجدار بلطف لتجنب انفصال العلاج بالصدمات الكهربائية عن القاع. استبدل الوسط كل يوم ب 500 ميكرولتر من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية حتى التحليل. في النقاط الزمنية المطلوبة، استخدم مجهر ستيريو لتسجيل الصور المجهرية للمناظر العلوية والجانبية ل ECT.
استخدم برنامج معالجة الصور لإجراء تحليل مسح خطي. قم بتعيين مقياس واستخدم أداة الخط المستقيم لتتبع وقياس أقطار العلاج بالصدمات الكهربائية بحد أدنى ستة مواقع لكل ذراع في كل طائرة تصوير. صورة لوحة الصب 48 جيدا تحت جهاز تسجيل مع كاميرا مسح منطقة متكاملة وضعت على مسافة ثابتة مجهزة عالية الدقة استشعار صورة أحادية اللون ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة.
إجراء الكشف الآلي للأقطاب'نصائح تحتوي على صبغة الفلورسنت لتعظيم التباين. قياس المسافة بين القطبين من السجلات اليومية باستخدام تحليل الآلي عن طريق تشغيل الصور المسجلة على البرمجيات للكشف عن بكسل مشرق عالية التباين على خلفية مظلمة أو برنامج معالجة الصور. إزالة العلاج بالصدمات الكهربائية من الاحتفاظ أعمدة وإدراج ربط نقل وحلقة العلاج بالصدمات الكهربائية.
ثم نقل العلاج بالصدمات الكهربائية على اثنين من السنانير فرضت على الذراع الثابتة وذراع محول من ريومتر الميكانيكية الديناميكية التمديدية مجهزة حمام الجهاز 37 درجة مئوية خفف مليئة برنامج تلفزيوني. تطبيق التوتر أحادية الجنس بمعدل خطي ثابت عن طريق تعيين ريومتر في حوالي 1٪ من المسافة الأولية بين السنانير في الثانية الواحدة. يمكن استخدام معدل تمدد ثابت يبلغ 0.03 ملليمتر في الثانية مع أبعاد العلاج بالصدمات الكهربائية النموذجية.
المسيل للدموع قوة محول وبدء تمتد. استمر في التسجيل حتى نقطة تمزق العلاج بالصدمات الكهربائية بعد تطبيع القوة المقاسة حسب المنطقة المقطعية العرضية ورسم منحنى الإجهاد الإجهادي لتحديد المعلمات الميكانيكية الحيوية المختلفة. قبل أن يبدأ النسيج في التكسير الدقيق ، يتوافق الحد الأعلى للمنطقة المرنة مع نقطة الغلة وسلالته هي مقياس لمرونة الأنسجة.
منطقة البلاستيك بين نقطة الغلة ونقطة الفشل. تتوافق نقطة الفشل مع انخفاض مفاجئ في الإجهاد بسبب تمزق الأنسجة ، وتحديد السلالة النهائية التي هي مقياس لتمدد الأنسجة. نقطة القياس الثالثة يتوافق مع أقصى قوة محددة من قبل أعلى الإجهاد أن الأنسجة يمكن أن تتحمل دون كسر خلال فترة التمدد.
المرونة والصلابة التي تعطيها المنطقة تحت المنحنى يتوافق مع الطاقة التي يمتصها النسيج حتى نقطة الغلة ونقطة الفشل على التوالي. لكل منحنى تم الحصول عليه، يتوافق منحدر الجزء الخطي من المنطقة المرنة مع معامل يونغ، المعروف أيضا باسم معامل المرونة. وهي خاصية الميكانيكية التي تقيس صلابة الأنسجة.
باستخدام هذا البروتوكول، ECT الضغط والانكماش في ظل ظروف السيطرة وفي وجود FCS تلت بضع ساعات بعد الصب وزيادة ملحوظة تصل إلى اليوم الخامس. عندما عولج العلاج بالصدمات الكهربائية مع مثبط البلمرة أكتين Latrunculin A، تم تخفيض ضغط العلاج بالصدمات الكهربائية كما هو مبين من قبل منطقة المقطع العرضي أعلى بكثير بالمقارنة مع السيطرة. تم تقييم تقلص الأنسجة خلال الأيام الخمسة من الثقافة.
في غياب لاتورونكولين A، زاد الانكماش تدريجيا حتى اليوم الخامس ليصل إلى حوالي 40٪انكماش. ومع ذلك، أثر وجود Latrunculin A على تقلص الأنسجة مما أدى إلى انكماش 20٪ كحد أقصى فقط. أدى تثبيط البلمرة Actin إلى انخفاض كبير بنسبة 50٪ تقريبا في تصلب الأنسجة على التحكم.
هذه النتائج تثبت أن سلامة الهيكل الخلوي actin ضروري لضغط العلاج بالصدمات الكهربائية, انكماش, وتصلب. من المهم تحديد حل الكولاجين الموثوق عالي الجودة وضمان استخدام تعليق أحادي الخلية ذو قابلية عالية للحياة لإعادة تشكيل الأنسجة الضامة المهندسة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
يسمح هذا البروتوكول للخلايا الليفية ببناء وتنظيم بيئتها الخاصة تحت ظروف ميكانيكية محددة، مما يؤدي إلى أنسجة متباينة الخواص تحاكي البيئة الطبيعية. إنه يمكّن من مقارنة ما يصل إلى 48 حالة بشكل متوازٍ ويمكن تكييفه مع أنواع مختلفة من الخلايا وظروف التكاثر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة الأنسجة الضامة
- بيولوجيا الخلايا الليفية
- الدراسات الآلية
الخلفية
- تلعب الخلايا الليفية دورًا حاسمًا في بنية الأنسجة ووظيفتها.
- فهم سلوكها في البيئات المهندسة يمكن أن يسهم في نمذجة الأمراض.
- تعتبر الأمراض الليفية مجالًا مهمًا للبحث بسبب تأثيرها على الصحة.
- غالبًا ما تفتقر الطرق الحالية إلى التكرار والمرونة.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول قابل للتكرار لتوليد الأنسجة الضامة المهندسة.
- تسهيل الدراسات الآلية وفحص الأدوية للأمراض الليفية.
- السماح بمقارنة ظروف تجريبية متعددة في وقت واحد.
الطرق المستخدمة
- استخدام لوحة متعددة الآبار ذات أقطاب مزدوجة لزراعة الأنسجة.
- تطبيق ظروف ميكانيكية محددة على الخلايا الليفية.
- دمج عوامل مؤيدة للليف أو عقاقير مضادة للليف.
- تقييم صلابة الأنسجة وتكوين المصفوفة.
النتائج الرئيسية
- أظهرت الأنسجة المهندسة صلابة وتكوينات مصفوفة مماثلة للبيئات الطبيعية.
- أظهر البروتوكول مرونة عبر أنواع مختلفة من الخلايا.
- تم تأكيد التكرار عبر مختبرات متعددة.
- اكتُسبت رؤى حول آليات المرض الليفي من خلال تطبيق الأدوية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيّمة لدراسة الأمراض الليفية.
- يعزز القدرة على إجراء تجارب متوازية تحت ظروف مضبوطة.
- تجعل قابلية الأسلوب للتكيف منه مناسبًا لتطبيقات بحثية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible generation of human-derived engineered connective tissues (ECT) in a 48-well format, providing a scalable 3D model for studying fibroblast behavior under defined biomechanical load. It supports mechanistic de-risking of antifibrotic targets by allowing parallel testing of pro-fibrotic factors and drug candidates, with quantitative readouts on tissue compaction, contraction, and stiffness. The system enhances predictive confidence in early discovery by modeling human-relevant tissue responses to pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation under controlled mechanical and biochemical conditions.
- Scientific Value: Supports functional validation of antifibrotic targets through dose-response analysis of compounds like Latrunculin A on tissue contraction and stiffness.
- Operational Value: Facilitates target de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level biomechanical outcomes in a human-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, high-throughput platform for screening compounds affecting tissue mechanics, with readouts on compaction, contraction, and elastic modulus.
- Operational Value: Enables parallel testing of up to 48 conditions per plate, supporting dose-response and time-course assays under consistent biomechanical loading.
- Operational Value: Uses defined, minimal components (collagen I, FGM, NaOH) to ensure reproducibility across laboratories and minimize batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human cardiac fibroblast responses in a 3D environment, improving translational relevance over 2D cultures for fibrosis mechanism studies.
- Scientific Value: Allows study of tissue-level phenotypes such as stiffness and extensibility, which correlate with pathological remodeling in fibrotic diseases.
- Operational Value: Supports longitudinal analysis of tissue dynamics over five days, enabling chronic compound exposure studies relevant to preclinical efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing a human-relevant 3D assay for mechanism-of-action confirmation and phenotypic screening in fibrosis programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fibroblast-matrix interactions and pathway modulation under defined tensile load.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (tissue diameter, contraction %, Young’s modulus) for hit validation and SAR progression.
- Analytics: Enables automated image-based analysis of tissue geometry and stress-strain profiling for objective, data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to pathophysiological relevance by measuring tissue stiffness and failure points analogous to fibrotic remodeling.
- Enterprise Reuse: The 48-well format and minimal reagent requirements allow integration into existing screening infrastructures with low adaptation cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cell-matrix contributions to tissue stiffening and contractility.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized cell preparation, hydrogel mixing, and casting parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-predictive data on antifibrotic efficacy and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on dose-dependent effects on tissue mechanics and actin integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture, hydrogel handling, and sterile technique to ensure cell viability and matrix integrity.
- Dependent on access to a dynamic mechanical riometer with temperature-controlled bath and automated image analysis tools for biomechanical profiling.
- Necessitates standardization of cell seeding density (8.9 million cells/mL) and collagen neutralization across users to minimize variability in tissue formation.
- Adaptation to non-cardiac fibroblasts may require optimization of culture medium and loading conditions to reflect tissue-specific phenotypes.
- Limited to endpoints assessable via tissue geometry and tensile testing; molecular readouts require parallel sampling or fixation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Primary Cardiac Fibroblast Preparation
1:39
Enzymatic Dispersion of Human Cardiac Fibroblasts
2:52
Engineered Connective Tissue Preparation
5:28
Cross-Sectional Area Measurement to Assess ECT Compaction
5:55
Pole Deflection Analysis to Monitor ECT Contraction
6:32
Destructive Tensile Measurement and Stress-Strain Analysis to Assess ECT
8:20
Results: Effect of Actin Polymerization on ECT Compaction, Contraction, and Stiffness
9:22
Conclusion
