أنسنة وسيط الافراج عن المقايسة كمقروءة لقوة مسببات الحساسية

يمثل المقايسة أداة بحثية مهمة لمحاكاة عمليات التخلص من الخلايا القاعدية الناجمة عن الربط المتبادل بين المرضى والمواد المسببة للحساسية. وبالتالي يمكن استخدام المقايسة لمحاكاة النوع 1 ، ردود الفعل التحسسية. المقايسة قوية وقابلة للاستنساخ وقابلة للتكييف.

وعلاوة على ذلك، فإنه حساس للغاية كما يمكن أن يؤديها مع كميات صغيرة من مسببات الحساسية المؤتلف أو تنقيتها أو حتى مع مقتطفات مسببات الحساسية المعقدة. يتم استخدام هذه الطريقة لتشخيص الحساسية لأنها تحلل التفاعل بين المرضى'IgE لمسببات الحساسية. أيضا هذه الطريقة مناسبة لتحليل التفاعل المتبادل ورصد فعالية العلاج AIT.

ابدأ بحصاد خلايا Ag8 من قارورة زراعة الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي. بيليه أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق، في 250 مرة ز في درجة حرارة الغرفة. يستنشق العملاق، وإعادة إنفاق بيليه الخلية إلى تركيز نهائي من حوالي مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة، لكل ملليلتر في أنسنة، RBL الخلايا المتوسطة.

تمييع سيرا الإنسان 1-10 في تعليق الخلية Ag8 لتخفيف المصل النهائي من 1 إلى 20 في المقايسة، واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل خلايا RBL المؤنسة إلى 50 إلى 90٪ التقاء ، يستنشق الوسط من قارورة ثقافة الخلية T-75 بعناية دون لمس خلايا RBL المؤنثة. اغسل الخلايا مرتين بإضافة 10 ملليلتر من DPBS إلى الجانب الآخر من القارورة وليس مباشرة إلى الخلايا.

أسبيرات DPBS، إضافة خمسة ملليلتر من ما قبل الاحماء مرة واحدة تريبسين-EDTA مفرزة الخلية واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. اضغط برفق على القارورة لفصل الخلايا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليمتر وملء الأنبوب مع أنسنة RBL الخلية المتوسطة أو DPBS لتخفيف تريبسين-EDTA.

طرد الخلايا في 250 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant، وإعادة إنفاق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة خلية RBL أنسنة لعد الخلايا. بعد عد الخلايا، تمييع الخلايا في المتوسط خلية RBL أنسنة للحصول على تركيز النهائي من مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر.

إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية RBL أنسنة، في بئر، أي ما يعادل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في لوحة معقمة 96 جيدا. الطرد المركزي تعليق مصل Ag8 المحتضن مسبقا ونقل 50 ميكرولتر من تعليق مصل Ag8 الطرد المركزي إلى كل بئر تحتوي على خلايا RBL أنسنة، دون إزعاج بيليه الخلية Ag8. استخدام الخلايا غير المحفزة الحساسة دون مستضد كما لا يوجد عنصر تحكم مستضد للإشارة إلى هضبة الإشارة السفلية أو الخلفية، ولا توعية الخلفية والحد الأقصى الآبار التحكم تحلل.

تغطية لوحة مع الغطاء واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. أسبيرات سيرا التي تحتوي على خلية المتوسطة، عكس والاستفادة من لوحة على الورق ماصة لتفريغ لوحة لغسل خلايا RBL أنسنة. غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من العازلة التيرود لكل بئر، واحتضان لمدة 30 ثانية تقريبا لكل غسل لأول غسلين.

بعد إضافة المخزن المؤقت لتيرود للمرة الثالثة، يستنشق المخزن المؤقت وترك الحل في الآبار حتى تصبح جاهزة لإضافة تخفيف مستضد. نقل 100 ميكرولتر من محلول مستضد لكل بئر تحتوي على خلايا RBL المؤنسة قبل التوعية ، ولكنها لا تحفز الحد الأقصى من التحلل والخلايا الخلفية غير الحساسة مع المستضد. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التيرود في الآبار الحد الأقصى للسيطرة على تحلل، غير حساسة الآبار مراقبة الخلفية، وتوعية الآبار لا مستضد.

احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة إلى 7٪ ثاني أكسيد الكربون. علاج الحد الأقصى للتحلل السيطرة الآبار مع 10 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 لكل بئر، وتخلط بشكل صحيح لتحلل الخلايا تماما لاطلاق سراح 100٪ من بيتا هيكسوسامينيديز. إضافة 50 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى لوحة جديدة غير ملزمة 96 بئر.

نقل 50 ميكرولتر من النافورات من آبار خلايا RBL المؤننة التي تحتوي على لوحة في لوحة جديدة تحتوي على محلول الركيزة واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية للسماح بتحويل الركيزة الفلورية. أضف 100 ميكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر وقاس الفلورسينس كما هو موضح في المخطوطة النصية. منحنى على شكل جرس التي تم الحصول عليها في اختبار نشاط بيتا هيكسوسامينيديز، مما يشير إلى الاحتلال أحادي التكافؤ من الظهارة مستضد من الغلوبولين المناعي E بسبب فائض من مسببات الحساسية، مما يمنع الغلوبولين المناعي مسببات الحساسية E عبر ربط في تركيزات مستضد عالية.

تم حساب تركيز المستضد اللازم لإطلاق الوسيط الأقصى نصف باستخدام تحليل الانحدار الخطي. تم إجراء فحص صلاحية الخلية لاستبعاد الآثار السامة للخلايا المستمدة إما من مصل التوعية أو المستضد المستخدم للتحفيز. تم استخدام خمسة أمصال بشرية مختلفة لإجراء فحص نشاط بيتا هيكسوسامينيداز ، واستجابت أربعة من أصل خمسة سيرا مشتقة من مرضى حساسية حبوب اللقاح البتولا لتحفيز Bet v 1 ، مما يدل على أن Bet v 1 هو مسبب حساسية قوي مسؤول عن أعراض الحساسية بوساطة المناعية E.

تم تقييم التفاعل المتبادل للغلوبولين المناعي E لمسببات الحساسية المثلية. تم العثور على الاستجابة لبيت الخامس 1 في كلا المريضين، ولكن المريض الثاني استجاب أيضا لكور 1. الرهان ضد 1 مسببات الحساسية الغذائية متجانسة, مما يدل على ارتفاع كور 1 عبر التفاعلية المناعية مستويات E في المريض الثاني.

تم تقييم الطبيعة هيبوالرجينيك للمتغيرات متحولة من المواد المسببة للحساسية ومقارنتها مع نظيرتها نوع البرية. تحول منحنى الإطلاق من متغير Bet v 1 fold نحو تركيز مستضد أعلى مقارنة بمسببات الحساسية من النوع البري ، مما أدى إلى تركيز أعلى بكثير من المستضد لإثارة إطلاق نصف الحد الأقصى ، مما يجعل المتحول أقل حساسية وبالتالي مرشحا للعلاج المناعي المحدد لمسببات الحساسية. لا تنسى أن تترك حلول الغسيل على الخلايا حتى تطبيق تمييع مستضد لتجنب الخلايا من الجفاف، وإلا، وهذا من شأنه أن يؤدي إلى ضعف أداء المقايسة.

يمكن استخدام المقايسة للعديد من التطبيقات المختلفة ، بما في ذلك توحيد المنتجات المسببة للحساسية ، استنادا إلى نشاطها البيولوجي ، مثل حلول اختبار وخز الجلد أو المستخلصات المستخدمة في العلاج المناعي المحدد لمسببات الحساسية.