عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .

هذا البروتوكول يسد فجوة تقنية للدراسة الكيميائية الحيوية للC.elegans ويوسع فائدتها ككائن حي نموذجي. هذه التقنية بسيطة وقوية على حد سواء، مما يسمح لعزل ثابت لاستخراج C.elegans النووية النشطة وظيفيا. ابدأ بوضع L1 المتزامنة على لوحات تحتوي على النيماتودا نمو 10 150 ملليمترا المبذورة مع الإشريكية القولونية OP50 ، والسماح للحيوانات بالنمو لمدة 48 ساعة عند 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4.

بمجرد إعداد المخازن المؤقتة هيكتونيك وhypertonic، تنظيف المتجانس بالش عن طريق إغراق غرفة طحن مع الإيثانول 70٪. ثم شطف الغرفة بالماء deionized لإزالة الإيثانول الزائد. أدخل كرة كربيد التنغستن في غرفة الطحن.

قم بسقف نهايات برميل المتجانس بالش، وتأمين القبعات باستخدام أطقم الإبهام المقدمة. ثم قم بإعداد خمسة ملليلترات من المخازن المؤقتة الهكتونية والهايبرتونية الكاملة لكل عينة كما هو موضح في مخطوطة النص. ملء المقبل معقمة، حقنة ملليلتر اثنين مع ملليلتر واحد من العازلة هيبوتونيك كاملة، وتدفق بلطف غرفة طحن المتجانس بالش، وترك ما يقرب من 500 ميكرولتر من العازلة هيبوتونيك كاملة في الغرفة.

تخزين التجانس مسح على الجليد، والسماح لها تبرد لمدة 30 دقيقة. جمع الحيوانات L4 تغذية جيدة مع العازلة M9 في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي الحيوانات في 1000 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. إزالة supernatant، ومواصلة غسل بيليه الحيوان حتى الناسل هو واضح.

غسل المقبل الحيوانات مع ثلاثة ملليلتر من العازلة هيبوتونيك الباردة، والطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح. بعد إزالة العازلة هيبوتونيك العملاقة، إضافة ملليلتر واحد من العازلة هيبوتونيك كاملة إلى بيليه الحيوان، ونقل تعليق الحيوان إلى حقنة جديدة معقمة، واثنين من ملليلتر. لتجانس الحيوانات المحفوظة على الجليد، ودفع بلطف الحيوانات من خلال غرفة طحن من المتجانس بالش محملة الكرة التنغستن.

ثم جمع الحيوانات مرة أخرى في الحقنة، وتكرار هذا الإجراء 30 مرة. بعد 30 دورة من التجانس، وجمع أقصى تعليق الحيوان من المتجانس بالش، وتخزين الحقنة مع طرف وضعه إلى أسفل داخل الأنابيب الدقيقة 1.7 ملليلتر. إزالة الكرة التنغستن، وتنظيف غرفة طحن مع الماء deionized.

الجافة والعودة الكرة إلى أنبوب المسمى كل منها. ثم أدخل الكرة التنغستن مع 7.9880 ملليمتر قطرها و12 ميكرومتر إزالة الفجوة في غرفة طحن، وإعادة ختم المتجانس. طرد غرفة طحن مرة أخرى مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة العازلة ناقصة الطنين كاملة.

طحن تعليق 25 مرات كما هو موضح. نقل تعليق الحيوان إلى نظيفة، 1.7 ملليلتر يوتيوب، وتخزين التعليق على الجليد. بيليه أسفل الجثث الحيوانية والحطام عن طريق الطرد المركزي.

ماصة 40 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب وصفت بأنها جزء الإدخال، وتخزين الكسر على الجليد. نقل supernatant المتبقية إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر دون إزعاج بيليه، والطرد المركزي لبيليه النوى. ثم نقل supernatant دون إزعاج النوى بيليه إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر وصفت بأنها كسر السيتوسوليك.

لغسل بيليه النوى، أضف 500 ميكرولتر من العازلة هيبوتونيك كاملة إلى بيليه، وتعليق بيليه، والطرد المركزي في 4،000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الطرد المركزي، وإعادة إنفاق بيليه النووية في 500 ميكرولتر من العازلة تحت الحجرية كاملة جديدة، ومرة أخرى الطرد المركزي العينة كما هو موضح. ثم حل بيليه في 40 ميكرولتر من العازلة فرطتونية كاملة.

نقل التعليق النووي إلى أنبوب جديد 1.7 ملليلتر المسمى كسر النووية، وتخزينها على الجليد. تحديد تركيز البروتين من ثلاثة كسور باستخدام عدة الفلورسنت القياس الكمي. Aliquot الكسور النووية في أنابيب ذات استخدام واحد تحتوي على ستة ميكروغرام من البروتين النووي، وتجميد المفاجئة في الجليد الجاف وحمام الإيثانول.

تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. تظهر الصورة الهلامية التمثيلية منتجات النسخ من استخراج يرقات Caenorhabditis elegans L4 النووي باستخدام قالب الحمض النووي المروج ل CMV. أدت العزلة الناجحة للبروتينات النووية النشطة إلى وجود نطاق ثنائي أساسي 132 بعد نسخ في المختبر ، وأسفرت العزلة غير الناجحة عن فرقة ضعيفة أو عدم وجود فرقة.

تذكر تسمية المخازن المؤقتة الكاملة بوضوح. يمكن أن تضر المخازن المؤقتة غير المناسبة بوظائف البروتينات النووية. أيضا، والحفاظ على الجليد المجانس الباردة لمنع تحلل البروتينات.

وقد سمح تطوير هذه التقنية للباحثين بقياس معدل نسخ الحمض النووي الريبي من ال C.elegans خلال الظروف العصيبة، مما يدل على أن معدل النسخ الحيواني يمكن أن يتغير اعتمادا على الظروف البيئية.