قياس الرقم الحموضة، كيمياء الأكسدة، والقدرة التحللية للماكروبينوسومات باستخدام المجهر ثنائي الفلوروفوري نسبة القياس

نحن نصف بروتوكولات لقياس الرقم الحموضة، والأحداث التأكسدية، وهضم البروتين في الماكروبينوسومات الفردية في الخلايا الحية. يتم التركيز على المجهر المقنن ثنائي الفلوروفوري والمزايا التي يوفرها على التقنيات القائمة على السكان.

يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييم في الوقت الحقيقي لمختلف العمليات والمعلمات الكيميائية الحيوية داخل تجويف الماكروبينوسومات الفردية. ويمكن استخدام هذه الأساليب لاكتشاف المخدرات في بيولوجيا الخلية من macropinocytosis. يوفر هذا البروتوكول ميزة الكشف عن التغايرية على مستوى كل من الخلوية والعضوي.

قبل يوم واحد من الخلايا Raw264.7 البذور المقايسة في كثافة خمس مرات 10 إلى قوة الخلايا في 100 ميكرولتر لكل بئر، في أسفل الزجاج 96-جيدا لوحة مع الجانبين الأسود. في يوم الفحص تحقق ما إذا كانت الآبار التقاء 70٪ على الأقل. ثم غسل جميع الآبار مع 100 ميكرولتر من HBSS، prewarmed في 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من HBSS تحتوي على 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من TMR المسمى 70 كيلودالتون ديكستران و 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من الفلوريسين المسمى 70 كيلودالتون ديكستران في كل بئر ، ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال الحضانة، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وغسل الخلايا ست مرات ب 100 ميكرولتر من HBSS. بعد غسل الماضي إضافة 100 ميكرولتر من HBSS prewarmed إلى الخلايا ثم وضع لوحة على المجهر مع مرحلة ساخنة وغرفة.

بعد ضبط معلمات الإثارة والانبعاثات ل TMR والفلورسين حسب الحاجة ، احصل على صورة من كل بئر بالتناوب بين الفلوريفورين بين كل بئر. بعد الاستحواذ الأول ، تحقق مما إذا كانت جميع الآبار لا تزال في التركيز عبر اللوحة بأكملها ، ثم احصل على صور لكل بئر على فترات زمنية تتراوح بين دقيقة واحدة و 15 دقيقة للطول الزمني المطلوب. أثناء الحصول على الصورة، قم بضبط درجة الحموضة ل 50 ملليلتر من محلول غني بالبوتاسيوم مخزنة ب 25 ملليمولار HEPES إلى 7.5 باستخدام 10 حمض هيدروكلوريك مولار، أو 10 هيدروكسيد البوتاسيوم المولاري حسب الحاجة.

ثم ضبط درجة الحموضة من 350 ملليلتر aliquots من محلول غني بالبوتاسيوم المخزنة مع 25 ملليمولار MES إلى درجة الحموضة 6.5، درجة الحموضة 5.5 وhh 5.0. بمجرد اكتمال الحصول على الصورة ، قم بإزالة HBSS من لوحة 96 بئرا التي تحتوي على الخلايا وإضافة محلول غني بالبوتاسيوم عند pH 7.5. ثم أضف النيجريين بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر.

ضع اللوحة مرة أخرى على المجهر والحصول على صور لكل بئر باستخدام إعدادات الاستحواذ نفسها كما هو موضح سابقا. لقياس الأحداث التأكسدية داخل الماكروبينوسومات، البذور RAW264.7 الخلايا في لوحة 96 جيدا قبل يوم واحد من الفحص كما هو موضح سابقا. ثم في يوم من غسل جميع الآبار المقايسة مع 100 ميكرولتر من HBSS prewarmed إلى 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من HBSS تحتوي على 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من TMR المسمى 70 كيلودالتون ديكستران و 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من H2DCFDA المسمى 70 كيلودالتون ديكستران لكل بئر ، ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد إزالة لوحة من حاضنة غسل الخلايا ست مرات مع 100 ميكرولتر من HBSS. بعد الغسيل الأخير، أضف 100 ميكرولتر من HBSS إلى كل بئر ووضع اللوحة على المجهر.

بعد ضبط معلمات الإثارة والانبعاثات ل TMR و H2DCFDA حسب الحاجة ، احصل على صور لكل بئر على فترات تتراوح بين دقيقة واحدة و 15 دقيقة كما هو موضح سابقا. لقياس هضم البروتين داخل الماكروبينوسومات، البذور RAW264.7 الخلايا قبل يوم واحد من الفحص، كما هو موضح سابقا. ثم في يوم الفحص غسل جميع الآبار مع 100 ميكرولتر من HBSS prewarmed في 37 درجة مئوية.

إضافة المقبل 100 ميكرولتر من HBSS تحتوي على 0.025 ملليغرام لكل ملليلتر من TMR المسمى 70 كيلودالتون dextran في 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر BODIPY المسمى ovalbumin إلى كل بئر. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد إزالة الخلايا من الحاضنة، اغسلها ست مرات ب 100 ميكرولتر من HBSS.

بعد غسل الماضي إضافة 100 ميكرولتر من HBSS إلى كل بئر، ثم وضع لوحة على المجهر. بعد ضبط معلمات الإثارة والانبعاثات ل TMR و BODIPY حسب الحاجة ، احصل على صور لكل بئر على فترات تتراوح بين دقيقة و15 دقيقة كما هو موضح سابقا. عند قياس درجة الحموضة أو الأحداث التأكسدية أو تدهور البروتين في الماكروبينوسومات ، لا يمكن قياس ديناميكيات التحمض لفترة زمنية معينة تتوافق مع مرحلة تحميل الدكستران ، والتي تختلف وفقا لنوع الخلية المستخدمة.

عند قياس درجة الحموضة الماكروبينوسوم، فإن نسبة الفلورسين إلى TMR تصبح أصغر تدريجيا وسوف تستقر في غضون 15 دقيقة من الاستحواذ. هذه الهضبة تقابل pH من حوالي خمسة، والذي يطابق تقريبا pH من الليسوسومات. في نهاية كل عملية استحواذ، يتم إجراء معايرة في الموقع.

يجب أن تكون نسبة الفلورسين إلى TMR أكبر داخل حاجز المعايرة عند درجة الحموضة 7.5 وتصبح أصغر تدريجيا مع زيادة حموضة مخازن المعايرة. وهذا يسمح لتوليد منحنى المعايرة. عند قياس الأحداث التأكسدية داخل الماكروبينوسومات، فإن نسبة H2DCFDA إلى TMR تصبح أكبر تدريجيا ومن المرجح أن تستقر خلال أول 20 إلى 30 دقيقة في خلايا RAW264.7 المنشطة.

عند قياس هضم البروتين الماكروبينوسومي ، سيتم تحرير إشارة فلوريسين قوية تدريجيا مع هضم البون البيضاوي. في الخلايا RAW264.7 ، فإن الزيادة في الفلورسينس المحررة من الجسم المهضوم المسمى ovalbumin ، سوف تستقر في غضون الدقائق ال 30 الأولى. مع هذا الدور الناشئ في التوازن وانها اكتشفت حديثا أهمية لأمراض السرطان، ويجري حاليا بحث macropinocytosis عصر النهضة.

هذه الأساليب المقدمة إلى مربع أداة لاستكشاف مساهمة macropinocytosis لهذه المجالات من الدراسة.