Microelectrode صفيف تسجيل سينواتري عقدة معدل اطلاق النار لتحديد عيوب الإيقاع القلب الجوهرية في الفئران
يوليو 5, 2021
يهدف هذا البروتوكول إلى وصف منهجية جديدة لقياس معدل إطلاق القلب الجوهري باستخدام تسجيل صفيف microelectrode لأنسجة العقدة الصينية الصناعية بأكملها لتحديد عيوب صنع الإيقاع في الفئران. يمكن أيضا إدخال العوامل الدوائية في هذه الطريقة لدراسة آثارها على صنع الإيقاع الجوهري.
قياس معدل ضربات القلب الجوهري هو مؤشر مهم على صحة القلب. تقيس هذه التقنية بدقة هذا المعدل مع استبعاد غالبية التأثيرات المحيرة على العقدة الصينية. يلتقط تسجيل MEA لمعدل ضربات القلب الجوهري بيانات معدل إطلاق دقيقة مشابهة لتسجيلات الخلية الواحدة دون تدريب مكثف على علم الفيزيولوجيا الكهربية.
قد يكافح الأفراد الذين يستخدمون هذه التقنية للحصول على مستحضرات أنسجة صحية في التجارب المبكرة ، لذلك مارس التشريح وتحسين المخازن المؤقتة وإعدادات جمع البيانات قبل البدء في جمع البيانات الحقيقية. إثبات الإجراء سيكون الطبيبان مان سي وبرافين كومار، باحثا ما بعد الدكتوراه في مختبري. تبدأ عن طريق عقد الجلد من الماوس القتل الرحيم مع hemostat واستخدام مقص الجراحية لجعل شق عرضية في الجلد فقط تحت الجزء السفلي من القفص الصدري من القوس كوستال الأيسر إلى قوس كوستال الأيمن.
استخدام مقص الجراحية لقطع فتح الصفاق وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز دون سرقة الكبد لمنع النزيف المفرط. انسي الحجاب الحاجز على طول الصدر لفضح تجويف الصدر. استخدم المقص الجراحي لقطع الجدران الجانبية للضلع من حواف الأقواس costal حتى الترقوة لفضح القلب، ثم استخدم إبرة حقنة قياس 23 لتثبيت القفص الصدري على الكتف.
استخدام ماصة نقل لإسقاط الحارة heparinized حل تايرود كاملة على القلب للحفاظ على رطوبة. عقد الرئتين مع ملقط Graefe غرامة اضافية وقطع القصبة الهوائية مع مقص الجراحية لإزالة الرئتين. لإزالة القلب، عقد قمة القلب مع ملقط Graefe غرامة اضافية وقطع الشريان الأورطي وأدنى فينا كافا مع مقص الجراحية.
نقل القلب إلى طبق بيتري التي تحتوي على إلستومر السيليكون الشفاء واستخدام ماصة نقل للاستحمام القلب مع اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول تايرود الكامل الدافئة. إرفاق قمة القلب إلى الطبق مع دبوس تشريح. عقد كافا فينا أدنى مع دومون 2 ملقط استئصال الأمين.
إدراج إبرة حقنة قياس 22 من خلال الوريدا كافا أدنى ومتفوقة لتحديد موقعها في الأذين الأيمن، والذي يحدد أيضا الموقف التقريبي للعقدة سيناويني. عقد الزوائد الأذينية الحق مع ملقط استئصال اللامينكتوم دومون 2، ووضع دبوس تشريح من خلال الملحق الأذيني الأيمن لعقد في مكانه. كرر نفس الإجراء للزوائد الأذينية اليسرى، ثم قم بإزالة إبرة الحقنة التي تمتد إلى الكافا.
استخدام مقص كاستروفيجو لإزالة قمة القلب عن طريق إجراء شق عرضية عبر البطينين للافراج عن الدم من القلب، ثم غسل القلب عن طريق إضافة محلول تايرود الكامل الدافئة heparinized. استخدم مقص Castroviejo لقطع الحاجز الأذيني البطيني حتى يتم فصل الأذينين والحفاظ على الشق أقرب إلى البطين. قطع على طول الحاجز بين الارتواز لإزالة الأذين الأيسر.
ضع دبابيس التشريح في محيط الأذين الأيمن لجعله مسطحا. إزالة أي الدهون المتبقية، والأوعية، أو الأنسجة من الأذين باستخدام مقص كاستروفيجو وتحديد موقع العقدة sinoatrial في الأذين الأيمن. إضافة حل تايرود لنموذج حل الإدخال وبدوره على تدفق غاز كاربوجين لأوكسجين حل التيرود.
تعيين مضخة التجبير إلى 25 دورة في الدقيقة، والذي يعطي معدل تدفق من اثنين من ملليلتر في الدقيقة الواحدة. بعد بدء تشغيل المضخة، تأكد من أن المخزن المؤقت لا يتسرب من النظام وتعيين وحدة تحكم درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. استخدام دومون 55 ملقط لنقل الأنسجة تشريح من طبق بيتري تشريح على شبكة صفيف microelectrode.
ضع الأنسجة برفق مع فرشاة طلاء ناعمة لتراكب منطقة العقدة الصينية الصناعية لشبكة القطب الكهربائي. ثم ضع الشبكة فوق الأنسجة باستخدام ملقط العظام أو أي ملقط منحني. باستخدام ملقط العظام، ضع مرساة القيثارة على الشبكة لعقد كل شيء في مكانه.
ترتيب طبق صفيف microelectrode على لوحة موصل. ضع بعناية غطاء التغلغل على طبق الصفيف microelectrode دون إزعاج مرساة شريحة القيثارة وتأمين فجوة التغلغل مع الشريط. قم بتشغيل مكبر الصوت وإعداد سير عمل للتسجيل في البرنامج.
حدد beat_recording. قالب موفلو. فتحه وتعيين عدد من آثار، مدة التتبع، الفاصل الزمني تتبع، الجهد المدخلات، معدل أخذ العينات، وغيرها من المعلمات تسجيل وفقا لشروط التسجيل المطلوب.
انقر فوق الزر سجل وتشغيل لبدء التسجيل والحصول على البيانات لمدة 10 من مدة دقيقة واحدة مع دقيقتين من الفواصل الزمنية بين آثار. وقفة المضخة والتبديل أنابيب تدفق مضخة من حل تسجيل العادي إلى حل تايرود التي تحتوي على الدواء المطلوب من الاختيار. أعد تشغيل المضخة واستأنف التسجيل.
بمجرد وصول محلول التيرود المشبع بالمخدرات إلى الأنسجة ، سجل 10 آثار بنفس الطريقة التي تم إجراؤها سابقا للتسجيلات الأساسية. التقاط صورة نهائية لتحديد المواقع من الأنسجة على مجموعة microelectrode. افتح ملف البيانات المسجل المحفوظ في قالب تحليل تردد فوز برنامج التحليل.
انقر على اللعب والسماح للتسجيل بأكمله لتشغيل التصور البيانات ومن ثم تعيين معلمات التحليل المناسبة. حدد القنوات التي سيتم تضمينها في التحليل وتعيين الحد الأقصى للسعة المطلوبة أو قيم عتبة السعة المصغرة لتحديد ذروة الموجي الآلي. انقر على أيقونة التشغيل مرة أخرى لإعادة تشغيل مجموعة البيانات وتأكيد أن معلمات التحليل مناسبة لاستخراج الارتفاع.
وللتحليل، حدد الآثار الثلاثة الأكثر استقرارا على التوالي التي تظهر معدل ضرب مستقر لكل أثر عبر معظم القنوات خلال فترة خط الأساس للتجربة وثلاثة آثار مستقرة متتالية أخرى خلال فترة التعرض للمخدرات. انقر فوق رمز التشغيل والتسجيل لبدء التحليل. تم جمع البيانات من الذكور من النوع البرية 45 يوما الماوس السويسري الأسود لعقدة sinoatrial فاز قياس التردد.
وقد لوحظت الأشكال الموجية ذات الأشكال والسعات المختلفة في قنوات مختلفة وأظهرت جميع القنوات فترات فاصلة متطابقة وترددات إطلاق. ومع ذلك، فإن درجة ملامسة الأنسجة للقطب الكهربائي قد تؤثر أيضا على خصائص الشكل الموجي مثل السعة. ومن بين الآثار العشرة المسجلة، اختيرت القنوات الثلاث المتتالية ذات التردد الثابت للنبض والفاصل الزمني بين البينيات لإجراء مزيد من التحليل.
يجب أن تكون أنماط الارتفاع المستخرجة السيئة غائبة ، ولكن إذا كانت موجودة إما تتأثر بالضوضاء أو غير مستقرة. تعكس الأشكال الموجية التي تتوافق مع نبضات القلب الفردية نشاط القلب الجوهري. يسمح نظام صفيف microelectrode بسهولة تطبيق عوامل المخدرات لتحليل الآثار الدوائية.
وتبين أن معدل الإطلاق الجوهري لثلاثة آثار مختارة عبر جميع القنوات ال 64 يبلغ حوالي 320 نبضة في الدقيقة في بيانات أخذ العينات. إدخال 4-aminopyrimidine زيادة فترات بين السبايك كما هو متوقع، مما أدى إلى انخفاض وتيرة فوز من 320 إلى 210 نبضة في الدقيقة الواحدة. لجمع بيانات موثوقة للتحليل، من المهم التأكد من صحة الأنسجة أثناء التسجيل من خلال التحقق من أن الآثار مستقرة وتفي بالمعايير القياسية.
يمكن استخدام MEAs لتسجيل النشاط القلبي في مناطق أخرى من القلب ، مما يسمح بتحديد مفصل للمنطقة قابل لدراسة آثار التلاعب الوراثي والصيدلاني.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يصف هذا البروتوكول منهجية لقياس معدل إطلاق القلب الداخلي باستخدام تسجيل مصفوفة القطب الدقيق لأنسجة العقدة الجيبي الأذينية في الفئران. تتيح التقنية تحديد عيوب تنظيم ضربات القلب وإدخال العوامل الدوائية لدراسة تأثيراتها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية
- تكنولوجيا مصفوفات القطب الدقيق
- التحليل الدوائي
الخلفية
- معدل القلب الداخلي هو مؤشر رئيسي لصحة القلب.
- القياس الدقيق لمعدلات الإطلاق ضروري لفهم وظيفة العقدة الجيبي الأذينية.
- قد تتطلب الطرق التقليدية تدريبًا مكثفًا على الفيزيولوجيا الكهربائية.
- تحضيرات الأنسجة الصحية ضرورية لجمع البيانات الموثوقة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لقياس معدلات إطلاق القلب الداخلي.
- تحديد عيوب تنظيم ضربات القلب في نماذج الفئران.
- تقييم تأثير العوامل الدوائية على تنظيم ضربات القلب الداخلي.
الطرق المستخدمة
- تسجيل مصفوفة القطب الدقيق لأنسجة العقدة الجيبي الأذينية.
- تشريح الفئران المقتولة للحصول على عينات الأنسجة.
- تحسين الوسائط وإعدادات جمع البيانات.
- التدريب على التقنيات الجراحية لتحضير الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- توفر التقنية بيانات معدل إطلاق دقيقة مماثلة لتسجيلات الخلية الواحدة.
- قد تتطلب التجارب الأولية ممارسة للحصول على تحضيرات أنسجة صحية.
- يمكن إدخال العوامل الدوائية بشكل فعال لدراسة تأثيراتها.
- تعزز موثوقية الإجراء عندما يجربه باحثون ذوو خبرة.
الاستنتاجات
- تقدم هذه المنهجية نهجًا قويًا لدراسة تنظيم ضربات القلب.
- تسهّل استكشاف الآليات القلبية الداخلية والتأثيرات الدوائية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية لمزيد من التحقيق في صحة القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of intrinsic cardiac firing rate is essential for identifying pacemaking defects and de-risking cardiovascular target validation. This microelectrode array method enables reliable, high-throughput assessment of sinoatrial node function in murine models, supporting mechanistic insight into autonomic-independent heart rate regulation. The approach bridges discovery electrophysiology with pharmacological screening, enhancing predictive confidence in early-stage cardiac safety and efficacy evaluations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac pacemaker function by isolating intrinsic firing rate from autonomic influences.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for validating genetic or pharmacological modulation of sinoatrial node activity.
- Strategic Value: Supports target confidence by confirming on-target effects of compounds modulating heart rate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, channel-resolved extracellular field potential data for beat frequency and interspike interval analysis.
- Operational Value: Allows simultaneous recording from 64 electrodes, increasing throughput and data robustness compared to single-cell methods.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization for cardiovascular liability screening and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables region-specific characterization of cardiac electrophysiology in whole-mount sinoatrial node preparations.
- Operational Value: Supports dose-response testing of pharmacological agents such as 4-aminopyrimidine to assess chronotropic effects.
- Strategic Value: Improves translational continuity by providing preclinical data directly comparable to clinical heart rate endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, by providing a scalable readout of pacemaker cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel or gene contributions to automaticity by measuring spontaneous firing rates.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (beats per minute, interspike interval) suitable for compound effect profiling.
- Analytics: Enables automated spike extraction and frequency analysis across multiple channels for consistent, objective quantification.
- Translational Research: Connects murine sinoatrial node function to human cardiac safety biomarkers through conserved pacemaker mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for chronic disease model testing and repeat pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in heart rate regulation by providing direct, autonomic-independent pacemaker readouts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through stable tissue preparation and consistent MEA-based signal acquisition.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by minimizing reliance on low-throughput, technically demanding patch-clamp or isolated heart methods.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets based on validated effects on intrinsic pacemaker function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac dissection and tissue handling to ensure viable sinoatrial node preparations.
- Dependent on microelectrode array instrumentation, perfusion systems, and electrophysiology amplifiers for extracellular recording.
- Necessitates standardization of buffer composition, temperature (37°C), and flow rate (2 mL/min) across laboratories for data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to disease models with structural or fibrotic atrial remodeling.
- Limited by tissue viability duration, necessitating timely experimentation post-dissection to maintain stable baseline recordings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Dissecting the Sinoatrial Node
3:50
Microelectrode Array System Preparation for Recording
4:18
Heart Tissue Placement on Microelectrode Array Grid
5:03
Data Acquisition
6:10
Analysis of Microelectrode Array Recordings for Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
7:13
Results: The Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
8:41
Conclusion
