Name: دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: تعلم طريقة الغطس اليدوي لتجميد العينات البيولوجية للمجهر الإلكتروني المبرد. يوضح هذا الفيديو إعداد الجهاز وتحضير الإيثان المسال وخطوات الطخة والغطس بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر أعضاء مختبر هيرزيك على التفكير النقدي وتقديم الملاحظات حول هذه المخطوطة ومحتوى الفيديو. M.A.H.Jr. مدعوم من قبل NIH R35 GM138206 وكباحث سيرل. H.P.M.N مدعوم بمنحة التدريب على الفيزياء الحيوية الجزيئية (NIH T32 GM008326). كما نود أن نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان والدكتور غابرييل لاندر في معهد سكريبس للأبحاث للمساعدة في تصميم وتجميع واختبار المكبس اليدوي المعروض في الفيديو.

ليس لدينا ما نكشفه

لا يزال تزجيج العينات البيولوجية للتصوير عن طريق المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) خطوة بالغة الأهمية لتحديد الهيكل الناجح. تمثل طريقة النشاف والغطس اليدوية الموصوفة في هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة وقوية لتجميد العينات البيولوجية بسرعة في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي للتصوير بالتبريد. وباستخدام الأساليب المبينة في المخطوطة، سيتمكن الباحثون من تجميع وتشغيل المكبس اليدوي، وإعداد المبرد المناسب للعينات البيولوجية التجميدية، وشبكات EM الملطخة يدويا التي تحتوي على عينات بيولوجية. في حين أن...

المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية هيكلية قوية يمكن استخدامها لحل هياكل العينات البيولوجية الديناميكية إلى الدقة شبه الذرية1،2،3،4. في الواقع ، التطورات الأخيرة في تقنيات كشف الإلكترونات المباشرة4،5،6،7،8،9،10 ، والتحسينات في مصادر الإلكترونات4،11،12،13،14 ، واستقرار العدسة الكهرومغناطيسية15 ، إلى جانب التطوير المستمر للحصول على البيانات 16,17 وحزم برامج التحليل18,19, مكنت الباحثين من تحديد هياكل العينات حسنة السلوك بشكل روتيني الآن إلى 3 دقة Å أو أفضل4,11,13,14,20,21,22,23 . على الرغم من هذه القدرات المحسنة للتصوير ومعالجة البيانات ، لا يزال إعداد شبكة cryoEM أكبر عائق أمام تحديد الهيكل عالي الدقة الناجح وغالبا ما يكون بمثابة اختناق كبير في سير عمل EM24،25،26،27.
تعتمد CryoEM على تصوير العينات البيولوجية في المحاليل المائية المجمدة لتشكيل فيلم رقيق من الجليد "الشبيه بالزجاج" - وهي عملية تعرف باسم التزجيج - تحافظ على الحالة الكيميائية الحيوية الأصلية. يعود تاريخ تزجيج العينات البيولوجية للكريويم إلى أكثر من 40 عاما28,29,30 وتعتمد العديد من التقنيات والمعدات التي تم تطويرها لهذه العملية على طريقة النشاف والغطس المفصلة في الأصل31,32,33,34,35 ، حيث يتم تطبيق حجم صغير من العينة (على سبيل المثال، 1-5 ميكرولتر) على شبكة EM متخصصة قبل إزالة المحلول الزائد باستخدام التفاعل المادي للشبكة مع ورق النشاف. عادة ما يتم تحديد توقيت هذه العملية تجريبيا لكل عينة كمكون حاسم لعينات التجميد هو سمك فيلم الجليد الزجاجي - إذا كان الجليد سميكا جدا ، فإن جودة التصوير تتدهور بشكل كبير بسبب زيادة تشتت شعاع الإلكترون في حين أن الجليد الرقيق جدا يمكن أن يحد من اتجاهات البروتين و / أو يستبعد الجسيمات من وسط ثقوب رقائق الشبكة36 . وقد أدى هذا الاعتماد على سمك الجليد المثالي لالتبريد أحادي الجسيمات إلى مجموعة واسعة من التقنيات والمعدات التي يمكن تجميد العينات، بما في ذلك الروبوتات37،38، microfluidics42، وأجهزة الموجات فوق الصوتية أو الرش27،39،40،41،42،43،44 . في السنوات الأخيرة ، تعتمد بعض أجهزة إعداد العينات الأكثر شعبية على استخدام الروبوتات للتجميد الآلي للعينات باستخدام تقنية النشاف والغطس45. في حين تم تصميم هذه الأجهزة لخلق سمك الجليد بشكل مستنسخ مناسب للتصوير ، إلا أنها غالبا ما تظل مكلفة للغاية بالنسبة للمختبرات الفردية للشراء والتشغيل وتوجد بشكل عام داخل مرافق cryoEM بأسعار الساعة للاستخدام. في السنوات الأخيرة، عادت تقنية النشاف والغطس اليدوية الأصلية إلى الاستخدام المتزايد3,47,48,49,50,51,52. في الواقع ، يمكن لجهاز النشاف والغطس الذي يتم تشغيله يدويا تحقيق شبكات cryoEM عالية الجودة بجزء صغير من تكلفة النظراء الروبوتيين. وعلاوة على ذلك ، فإن النشاف اليدوي يوفر أيضا المزيد من المستخدمين التحكم في النشاف حيث يمكن للباحثين ضبط نوع النشاف (أي النشاف الخلفي للشبكة ، والنشاف الأمامي للشبكة ، وما إلى ذلك) ، ووقت النشاف استنادا إلى كل عينة على حدة وأسئلة البحث.
في هذه المقالة، نقدم تفاصيل حول كيفية تجميد العينات البيولوجية بشكل فعال باستخدام جهاز التزجيج اليدوي التقليدي إلى جانب منصة dewar مصممة خصيصا53. وتقدم أفضل الممارسات، بما في ذلك إعداد cryogen، والتعامل مع الشبكة، وتطبيق العينة، والنشاف، فضلا عن المزالق المشتركة والتوصيات حول كيفية التغلب على هذه العقبات. وتناقش المشورة بشأن كيفية زيادة سمك الجليد استنساخ بين الاستعدادات الشبكة وكيفية تعديل النشاف عينة على أساس نوع العينة البيولوجية. نظرا لانخفاض التكلفة المرتبطة بشراء وتشغيل المكبس اليدوي الموصوف في هذه المخطوطة، يمكن للمختبرات في جميع أنحاء العالم إعداد عينات بيولوجية للكريويم بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.

<table><tbody><tr><td>4 فتحات صندوق تخزين شبكة</td><td>تيد بيلا</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14 قياس المعدن المسطح طرف الاستغناء عن المعدن</td><td></td> أمازون <td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22 × 22 مم غطاء زجاجي مربع Sigma</td><td></td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>60 مم طبق بتري زجاجي لتخزين الشبكات</td><td>فيشر</td><td>08-747A</td><td></td></tr><tr><td>100 مم طبق بتري زجاجي لتخزين ورق واتمان</td><td>فيشر</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري زجاجي 150 مم لتخزين ورق واتمان</td><td>فيشر</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250 مل دورق</td><td>فيشر</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>ستايروفوم أزرق ديوار</td><td>سبير لاب</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>وعاء إيثان نحاسي</td><td>لاسكو</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط</td><td>لقط تيد بيلا</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>مناديل مهمة دقيقة</td><td>فيشر</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>منظم ثنائي المرحلة مع صمام تحكم</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة شبكة</td><td>Dewer منصة UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethane</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>خزان البروبان الإيثان</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>الإيثان (50٪): البروبان (50٪) في خزان الضغط العالي</td></tr><tr><td>خزان الإيثان</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>الإيثان (100٪)</td></tr><tr><td>ضوء مهمة الذراع المرن</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Grids (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 شبكة)</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr> المرطب <tr><td></td><td>الهدف</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>مقياس الرطوبة</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>معطف المختبر</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>النيتروجين السائل dewar</td><td>Worthington</td><td>قفازات</td> النيتروجين السائل LD4 <td></td></tr><tr><td></td><td>فيشر</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>حامل المكبس اليدوي (حامل أسود + دواسة قدم)</td> <td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (منصة غطس) قفازات</td> <td>النتريل UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20 ماصة</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب PCR</td><td>Eppendorf</td><td>E0030124286</td><td></td></tr><tr><td>نصائح الماصة</td><td>مصباح إيبيس العلمي</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>الدائري</td><td>أمازون</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>نظارات السلامة مقص</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>أمازون</td><td>فيسكارس 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>مفك براغي</td> شريط <td>354711</td><td></td><td>أيرونسايد</td></tr><tr><td></td><td></td><td>فيشر 15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط لنقل صندوق الشبكة</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Blouting Paper</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

تصوير العينات البيولوجية مع الإلكترونات لتحديد هيكل عالية الدقة عن طريق المجهر الإلكتروني المبردة جسيمات واحدة (cryoEM) يتطلب طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية. على الرغم من التقدم التكنولوجي العديد في السنوات الأخيرة التي دفعت cryoEM جسيم واحد إلى طليعة البيولوجيا الهيكلية، والأساليب التي يتم بها تهتز العينات للتصوير عالية الدقة غالبا ما تبقى الخطوة التي تحد من معدل. على الرغم من أن العديد من الجهود الأخيرة وفرت وسائل للتغلب على العقبات التي كثيرا ما تواجه خلال تزجيج العينة ، بما في ذلك تطوير دعامات عينة جديدة وأجهزة التزجيج المبتكرة ، فإن المكبس التقليدي الذي يتم تشغيله يدويا لا يزال عنصرا أساسيا في مجتمع cryoEM بسبب انخفاض تكلفة الشراء وسهولة التشغيل. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام معيار، على غرار المقصلة تعمل يدويا جهاز لطخة والغطس لتزجيج العينات البيولوجية للتصوير عالية الدقة من قبل cryoEM جسيم واحد. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تواجه مشكلات وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها عندما يفشل إعداد قياسي في إنتاج عينة مناسبة يتم وصفها أيضا.

سيؤدي التنفيذ الناجح لبروتوكول النشاف والغطس الموصوف هنا إلى طبقة رقيقة وموحدة من الجليد الزجاجي الخالي من أي جليد سداسي وملوثات وتدرجات كبيرة من الجليد غير القابل للاستخدام والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني (الشكل 3). الاتصال غير المتسق لورق النشاف مع سطح الشبكة ، أو إزالة ورق النشاف قبل الأوان ، أو تحريك ورقة النشاف أثناء اتصال الشبكة يمكن أن يقلل من جودة الجليد الزجاجي ويؤدي إلى سمك جليدي غير متناسق عبر شبكة EM (الشكل 4)
<p class="jove_content" fo...

تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

طريقة الغطس اليدوي الموصوفة هنا هي طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة لإعداد عينات للفحص المجهري للإلكترون ناقل الحركة. في هذا الفيديو، سوف نبين كيفية إعداد المكبس اليدوي، وإعداد cryogen، وأداء النشاف اليدوي والغطس من شبكات EM. إعداد بيئة الهبوط اليدوي.يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في غرفة باردة يتم الحفاظ عليها عند 40 درجة مئوية مع رطوبة أكبر من 95٪نوصي باستخدام المواد المعروضة هنا وكما هو موضح في البروتوكول عبر الإنترنت للنشاف اليدوي والغطس. إعداد ديوار cryogen والغطاس اليدوي. لتجميع ديوار cryogen، أولا تثبيت قاعدة منصة في الجزء السفلي من ديوار الستايروفوم الأزرق، وضمان أنها مسطحة ومستوى.ثم ضع حامل سفينة الإيثان على قمة قاعدة المنصة وأدخل وعاء الإيثان النحاسي. وأخيرا، وضع منصة تخزين شبكة الغزل. بعد ذلك ، حدد موقع ديوار يغرق إلى قاعدة المكبس اليدوي.مركز سفينة الإيثان تحت الذراع يغرق وتأمين ديوار يغرق إلى القاعدة. لضبط ارتفاع الغطس اليدوي ، قم أولا بإرفاق شريط جديد بقاعدة الذراع المنغمسة. بعد ذلك ، قم بتثبيت زوج من ملاقط اللقط عن طريق لف الشريط بأمان حول الذراع المنغمسة وقاعدة الملاقط.تأكد من أن الملاقط متصلة بقوة عن طريق النقر عليها بخفة. عقد الذراع يغرق وخفض ببطء ملاقط في وعاء الإيثان النحاس عن طريق الاكتئاب دواسة القدم. ضبط موقع ديوار يغرق بحيث الملاقط تحديد موقع إلى منتصف سفينة الإيثان النحاس.نصائح من ملاقط لا ينبغي الاتصال حجم أو أسفل السفينة الإيثان النحاس لتجنب الأضرار التي لحقت ملاقط ومغطاس يدوي. بمجرد تعيين الموضع، أعد تعيين ذراع الغطس اليدوي. إعداد Cryogen.يجب إجراء إعداد Cryogen في غرفة جيدة التهوية ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات. للبدء، ضعف النيتروجين السائل مباشرة في ديوار يغرق، ووقف عندما يصل مستوى النيتروجين السائل الجزء العلوي من وعاء الإيثان النحاس. يجب أن يكون النظام باردا بما يكفي للمضي قدما بعد توقف النيتروجين السائل عن الفقاعات بعنف.سيستغرق هذا حوالي خمس دقائق. يأتي الإيثان كغاز مضغوط ويحتاج إلى تكثيف. لضبط تدفق الغاز لتكثيف الإيثان الأمثل، أدخل طرف خط غاز الإيثان في كوب من الماء طوله 250 مليون دولار ومراقبة الفقاعات.يجب أن ينتج تدفق الغاز تيارا ثابتا من الفقاعات التي لا تعطل سطح الماء بعنف. للبدء في تكثيف الإيثان، ضع طرف خط غاز الإيثان في الجزء السفلي من سفينة الإيثان النحاسية. تحريك ببطء طرف معدني والبدء في تسييل الإيثان.بمجرد أن يبدأ الإيثان في البرودة، سوف يصدر ضوضاء مسموعة. ملء السفينة الإيثان النحاس إلى ثلاثة أرباع كامل من الإيثان السائل. أعلى قبالة ديوار يغرق مع النيتروجين السائل، وضمان أنه يمس سفينة الإيثان النحاسية ولكن لا تسرب في ذلك.إضافة النيتروجين السائل ضروري لتجميد الإيثان موحدة. وضع غطاء الرغوة على ديوار الأزرق يغرق، والسماح للثان لترسيخ تماما. إعادة تشغيل تدفق غاز الإيثان ووضع بعناية غيض من خط الغاز في الإيثان الصلبة.من المهم وضع الطرف عموديا في السفينة والاستغناء عن الإيثان في الجزء السفلي. يحرك الطرف المعدني ببطء لإذابة الإيثان وإحضار مستوى الإيثان السائل إلى أعلى السفينة. أغلق الغطاء لمدة دقيقة واحدة تقريبا واسمح للإيثان بترسيخ حواف السفينة النحاسية حتى يظهر ما بين ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من الإيثان الصلب.الإيثان الآن في درجة حرارة مثالية لتجميد العينات البيولوجية. إرفاق ديوار يغرق بعناية إلى قاعدة المكبس اليدوي. ربط زوج من ملاقط لقط عن طريق التفاف الشريط بأمان حول الذراع يغرق وقاعدة ملاقط.عقد الذراع يغرق وخفض ببطء ملاقط في الإيثان السائل عن طريق الاكتئاب دواسة القدم. ضبط موقع ديوار يغرق بحيث الملاقط تحديد موقع إلى منتصف الإيثان السائل، وتجنب الاتصال مع حلقة الإيثان الصلبة. إعداد المواد والملحقات يغرق.إعداد ورقة النشاف عن طريق قطع كل ورقة تصفية دائرية إلى شرائح عرضها سنتيمتر واحد تقريبا. تجنب لمس مركز ورقة النشاف وتجاهل القطع الصغيرة. من المهم التأكد من أن شرائط الورق النشاف جافة ونظيفة وخالية من الملوثات.قبل الغطس، ضع صناديق الشبكة في ديوار يغرق في فتحات المناسبة. تأكد من أن الشبكة تغطي مجانا لتدوير. إعداد عينات CryoEM عن طريق يغرق تجميد.نظرا لتنوع الشبكة والشبكة الاستعدادات ، اتبع البروتوكولات الموصى بها لجعل الشبكات هيدروفيلي. للتعامل مع الشبكات بشكل صحيح، استخدم ملاقط لقط نظيفة وجافة لالتقاط الشبكات المائية في الحلقة الخارجية. قم بتمرير المشبك البلاستيكي لتأمين الشبكة واضغط على الملاقط برفق لضمان تثبيت الشبكة بشكل صحيح.تطبيق ثلاثة ميكرولترات من العينة إلى الجزء الأمامي من الشبكة التي عقدت في ملاقط لقط. إرفاق ملاقط بحزم إلى الذراع اليدوي يغرق عن طريق التفاف الشريط حول قاعدة ملاقط. العينة جاهزة الآن ليتم مسحها وتجميدها.عقد كل طرف من شريط نظيف من ورق النشاف بين أصابع السبابة والإبهام. بقية يديك على حافة ديوار يغرق لإنشاء موقف مستقر. يجب أن يكون ورق النشاف على بعد سنتيمتر واحد تقريبا من سطح الشبكة.ثني ورقة النشاف حتى يتصل المركز بالشبكة. من المهم أن تكون ورقة النشاف موازية لسطح الشبكة للسماح حتى بالاتصال ومنع تلف الشبكة. عندما تتوقف الجبهة السائلة المتنقلة عن الانتشار، ابدأ العد.لطخ الشبكة لخمس ثوان. افصل أصابعك، وجهد الورق النشاف وأزاله بسرعة من سطح الشبكة. في وقت واحد، اضغط على دواسة القدم للافراج عن الذراع الغطس اليدوي، يغرق الملاقط عقد الشبكة في الإيثان السائل.الحفاظ على الشبكة المجمدة حديثا في الإيثان السائل، وفصل بعناية ملاقط من الذراع يغرق دليل. بعناية الامم المتحدة المشبك ملاقط بحيث تكون الشبكة قابلة للإزالة. نقل الشبكة إلى خزان النيتروجين السائل تحت وعاء الإيثان النحاسي مع حركة واحدة سريعة من الإيثان إلى النيتروجين السائل.ضع الشبكة في مربع الشبكة. النتائج التمثيلية. من هذا الفيديو ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على إعداد شبكات CryoEM ، مثل هذا ، مع العديد من المربعات التي تحتوي على أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي للتصوير عالي الدقة.يمكن ضبط تركيز العينة ووقت النشاف لتحسين كثافة الجسيمات. هنا، سوف نظهر سير العمل الكامل لتجميد عينات CryoEM باستخدام أسلوب لطخة والغطس. استخدام ملاقط لقط نظيفة لالتقاط شبكة جديدة وتأمين الشبكة في مكان.تطبيق ثلاثة ميكرولترات من العينة إلى الجانب المائي من الشبكة وتأمين ملاقط إلى الذراع الغطس اليدوي عن طريق التفاف الشريط حول مقبض ملاقط. ضع الورق النشاف بالتوازي مع سطح الشبكة وثني الورق النشاف برفق نحو الشبكة لبدء النشاف. بعد الوقت المطلوب، قم بتحريك ورقة النشاف في حركة عض بعيدا عن سطح الشبكة بينما قم بتكئيب دواسة القدم لإطلاق الذراع المنغمسة، مما أغرق الشبكة في الإيثان السائل.فك بعناية الشريط من جميع أنحاء ملاقط والذراع اليدوي يغرق. مع حركة واحدة سريعة، نقل الشبكة بسرعة من وعاء الإيثان إلى خزان النيتروجين السائل. ضع الشبكة في مربع تخزين الشبكة ولف الملاقط في مسح كيم لتجف؛ كرر.

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نحن هنا لتوضيح كيفية استخدام الإلكترون cryotomography (ECT) لدراسة التركيب الدقيق للخلايا بكتيرية في القريب الناطقين الدول ، والى "الجزيئات" (~ 4 نانومتر) القرار.

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

وصفنا طريقة لتوطين البروتينات fluorescently المفتاحية في micrographs الإلكترون. يتم ترجمة باستخدام صور 1 مضان المجهري تنشيط الترجمة في أقسام سامسونج. ثم يتم محاذاة هذه الصور لmicrographs الإلكترون من نفس القسم.

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

البرد المجاهر الإلكترونية، إما الضوئي (SEM) أو ناقل الحركة (TEM)، وتستخدم على نطاق واسع لتوصيف العينات البيولوجية أو غيرها من المواد ذات المحتوى ارتفاع المياه 1. ويستخدم SEM / المركزة ايون الشعاع (فيبوناتشي) لتحديد ملامح الاهتمام العينات واستخراج، الإلكترون شفافة رقيقة لنقل الصفيحة إلى البرد TEM.

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

نقدم هنا بروتوكولا للجمع بين اثنين تقنيات تجهيز العينة، الضغط العالي تجميد وتجهيز عينة ساعدت الموجات الدقيقة، تليها الراتنج الدنيا التضمين للحصول على بيانات مع تركيز أيون شعاع مسح إلكتروني المجهري (التعزيز-وزارة شؤون المرأة). ويتجلى هذا باستخدام الماوس عصب ظنبوبي عينة و ايليجانس كاينورهابديتيس.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

هنا نعرض كيفية استخدام جهاز تجميد شطيرة للتجميد السريع للعينات البيولوجية، بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا المستزرعة والخلايا المعزولة والأنسجة الحيوانية والبشرية، والفيروسات. كما نعرض كيفية إعداد العينات للقسمة فائقة بعد التجميد السريع.

التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

هنا ، نصف بروتوكولا لتطبيق طبقة أحادية واحدة من الجرافين على شبكات المجهر الإلكتروني وكيفية تحضيرها للاستخدام في تحديد بنية cryoEM.

تصنيع شبكات أحادية الطبقة مطلية بالجرافين للمجهر الإلكتروني بالتبريد

تعلم طريقة الغطس اليدوي لتجميد العينات البيولوجية للمجهر الإلكتروني المبرد. يوضح هذا الفيديو إعداد الجهاز وتحضير الإيثان المسال وخطوات الطخة والغطس بدقة عالية.

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

استكشف المزيد من الفيديوهات