جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

تمكن هذه التقنية من دراسة وظيفة ونطاق جزيئات الإشارات أثناء تكوين الجنين عن طريق زرع مصادر الإشارات خارج الرحم. كما أنه يسهل توليد كفاءة من المسوخ الجرثومية. يمكن تطبيق البروتوكول على خشبة البحر الوحشي المرحلة blastula وأجنة ميداكا، وربما أيضا إلى المراحل الجنينية الأخرى والأنواع TDO.

لتجميع جهاز زرع، وربط تلميح إغراء 25 ميكرولتر الغاز حقنة ضيقة لحامل ماصة صغيرة باستخدام تركيب قفل إغراء. ثم قم بتركيب الجهاز مباشرة على مناور صغير يدوي. لاستخدام جهاز الزرع، ضع المتلاعب الصغير مع الجهاز المجمع بجوار مجهر ستيريو.

ثم إزالة المكبس وإدراج إبرة زرع. خفض الإبرة في طبق مملوء محلول رينغر في زاوية 45 درجة حتى يتم غمر غيض من الإبرة. أدخل المكبس في منتصف الطريق تقريبا لطرد حلول Ringer ، تاركا كمية صغيرة فقط من الماء في الجزء الرقيق من الإبرة.

عند استخدام إبرة زرع للمرة الأولى، معطف داخل الإبرة عن طريق رسم نير من الجنين التضحية وطرد المواد نير تماما. بعد ذلك ، باستخدام إبرة زرع ، ضع الجنين المتبرع برفق ، ثم ضع الإبرة التي تفتح متعامدة على سطح الجنين واسحب المكبس بعناية لرسم الخلايا في الإبرة. بمجرد سحب العدد المطلوب من الخلايا ، أوقف الشفط عن طريق دفع المكبس برفق إلى الأسفل وإزالة الإبرة من الجنين عن طريق الرجيج الإبرة إلى الجانب في حركة قصيرة وسريعة.

اترك محلول Ringer على جانبي عمود الخلية عن طريق تقييد الخلايا إلى نهاية الإبرة المدببة. مسح أي صفار المتبقية أو حطام الخلية عن طريق تحريك ببطء المكبس صعودا وهبوطا وغسل الخلايا مع محلول رينغر. بعد ذلك ، قم بتحريك طبق الزرع بيد غير مهيمنة لوضع الإبرة المتعامدة على سطح الجنين المضيف.

تطبيق ضغط طفيف على الجنين عن طريق الضغط بعناية على الجدران. ثم مع حركة حادة سريعة ، اخترق الطبقة المغلفة للجنين المضيف مع الحرص على عدم خدش الصفار بالإبرة. بمجرد أن تدخل الإبرة ، ادفع المكبس برفق لقذف عمود الخلايا في الجنين ، وتراجع الإبرة ببطء في وقت واحد.

لزرع الخلايا الجرثومية، وملء طبق زرع مع محلول رينغر، ثم نقل الكرة dechorionated إلى الأجنة مرحلة القبة في طبق زرع ووضع الأجنة المضيف والمانح في أعمدة بالتناوب لزرع الخلايا من جنين متبرع واحد إلى ستة أجنة مضيفة مختلفة. لتنفيذ عملية الزرع، توجيه الأجنة مع الهامش نحو إبرة زرع. لزرع الجرثومة، خذ الخلايا المصدر من الهامش وأودعها في نفس الموقع في الجنين المضيف.

بمجرد الانتهاء من عملية الزرع، اسمح للجنين بالتعافي في محلول رينغر لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ثم باستخدام مجهر ستيريو مضان، فحص الخلايا المزروعة. بعد ذلك ، نقل الأجنة إلى 24 طبق مغلفة Agarose جيدا مع الجنين المتوسط تجميع جميع الأجنة المضيفة التي تلقت خلايا من نفس المتبرع في نفس البئر.

ثم احتضان الأجنة في 28 درجة مئوية حتى اليوم التالي. إذا لزم الأمر، نقل الأجنة المانحة إلى شرائط PCR المسمى لل genotyping. بعد 30 ساعة من الإخصاب، قم بفحص الأجنة المضيفة لإجراء عمليات زرع الجرثومة الناجحة تحت مجهر ستيريو مضان.

يجب أن تكون الخلايا الجرثومية موجودة في الأخدود فوق امتداد الصفار. زراعة اليرقة المزروعة بنجاح إلى غطاء محرك السيارة للبالغين وفقا لظروف تربية قياسية. في عمليات الزرع الناجحة ، يبدو الجنين طبيعيا ومشابها في الشكل ووضوح الصفار للأجنة غير المخططة دون دموع كبيرة في blastoderm.

في المقابل، إذا كان الجنين معطوبا بشكل واضح أثناء الزرع، فلن يتطور بشكل طبيعي. على الرغم من أن جهاز الزرع قد استخدم بشكل رئيسي على أجنة حمار وحشي في مراحل blastula ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء الزرع وإزالة الخلايا في أجنة مرحلة blastula dechorionated من ميداكا سمك الأرز الياباني. في حالة زرع الجرثومة على وجه التحديد ، ينتج عن زرع جيد جنين مع عمود أفقي طويل من الخلايا فوق هامش الصفار مباشرة.

ومع ذلك ، لا يمكن تقييم نجاح الإجراء إلا بعد 24 إلى 30 ساعة من الإخصاب عندما تكون الخلايا الجرثومية متميزة في مضانها عن الخلايا الجسدية. ستظهر الخلايا الجرثومية البدائية كمجالات فلورية صغيرة في الأخدود مباشرة فوق امتداد الصفار. وجود هذه الخلايا الجرثومية في الموقع الصحيح يشير إلى نجاح زرع الجرثومة.

وترد هنا أمثلة على عمليات زرع غير ناجحة. في المثال الأول ، على الرغم من أن الخلايا الجرثومية قد وصلت إلى ميسودرم غدد الغدد التناسلية ، حيث أن الجنين المضيف مشوه بشدة ، إلا أنه لن يتطور بشكل طبيعي. في المثال الثاني، يتم الكشف عن الخلايا الفلورية فقط خارج الأخدود.

هذه الخلايا هي إما خلايا جسدية أو خلايا جرثومية فشلت في الهجرة بشكل صحيح. وكلا النوعين من الخلايا لن يساهم في الخط الجرثومي للجنين. من المهم تجنب تلف الخلايا المزروعة والجنين المضيف.

يجب رسم الخلايا ببطء، وتطهيرها من أي صفار المتبقية، ويتم إدراجها بعناية. توفر هذه الطريقة طريقة سهلة لزرع الخلايا في أجنة حمار وحشي ، وستكون مفيدة لتوليد مصادر خارج الرحم ومسوخ الجرثومة. الميزة الرئيسية لهذا الجهاز، فمن تكلفة منخفضة، والكثير ويستخدم.