Name: جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: اكتشف تقنية زرع الخلايا في أجنة سمك الزرد لدراسة جزيئات الإشارة أثناء تخلق الأجنة. تُسهّل هذه الطريقة إنشاء طفرات خطية جرثومية بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم هذا المشروع من قبل جمعية ماكس بلانك وحصل على تمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 (اتفاقية المنحة رقم 637840 (QUANTPATTERN) واتفاقية المنح رقم 863952 (ACE-OF-SPACE)).

<ol><li>Spemann, H., Mangold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+embryonic+primordia+by+implantation+of+organizers+from+a+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+for+Microscopic+Anatomy+and+Developmental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species.</a> Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).</li>
<li>Müller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336 (6082), 721-724 (2012).</li>
<li>Donovan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Activin-A+signaling+promotes+melanoma+growth+and+metastasis+through+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion.</a> Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).</li>
<li>Pomreinke, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BMP+signaling+and+distribution+during+zebrafish+dorsal-ventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning.</a> eLife. 6, 25861(2017).</li>
<li>Almuedo-Castillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-invariant+patterning+by+size-dependent+inhibition+of+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling.</a> Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).</li>
<li>Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Nodal+and+BMP+signaling+by+mutual+signaling+effector+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism.</a> Cell Reports. 31 (1), 107487(2020).</li>
<li>Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+reorganization+of+xanthophores+fine-tunes+and+colors+the+striped+pattern+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish.</a> Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).</li>
<li>Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iridophores+and+their+interactions+with+other+chromatophores+are+required+for+stripe+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish.</a> Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+Nodal+signal+Squint+functions+as+a+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen.</a> Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germline+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29.+4th+edn%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394(2009).</li>
<li>Capek, D., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), 177709(2019).</li>
<li>Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+stability+in+living+zebrafish+embryos+using+fluorescence+decay+after+photoconversion+%28FDAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266(2015).</li>
<li>Carvalho, L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yolk+syncytial+layer+in+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The yolk syncytial layer in early zebrafish development.</a> Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).</li>
<li>Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+of+medaka+embryos+and+cell+transplantation+for+the+generation+of+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055(2010).</li>
<li>Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+restriction+and+multipotency+in+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate restriction and multipotency in retinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).</li>
</ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

يعتمد نجاح تجربة الزرع بقوة على المهارات الحركية الدقيقة للمجرب. ومن أجل تنفيذ الإجراءات بنجاح، يلزم ممارسة هذه العملية. ومع ذلك ، فإن الأداة المعروضة هنا سهلة التعلم والاستخدام نسبيا مقارنة بالآخرين في السوق ، وبشكل عام ، لا تحتاج إلا إلى بضعة أيام من الممارسة.
يمكن تعزيز نجاح عملية الزرع من خلال اتخاذ العديد من الاحتياطات. خطوة واحدة هي التأكد من أن micromanipulator هو من نوعية جيدة وقادرة على التشغيل السلس. إضافة العين مع التكبير أعلى إلى المنظار المجسم يمكن أن تساعد على وضع الإبرة بدقة بالنسبة للجنين. كما أن استخدام سمك الحمار الوحشي أو ميداكا الذي يتكاثر بشكل جيد للحصول على أجنة سليمة والحرص على عدم إتلاف الأجنة أثناء المناولة (خاصة أثناء وبعد خطوة التخلص من المشيمة) سيعزز أيضا معدل النجاح.
يمكن أن تكون المشاكل المتعلقة بالسمية المتأخرة أكثر صعوبة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا توفي الجنين بعد بضع ساعات - ولكن ليس بعد زرعه مباشرة - فقد يكون الصفار قد تضرر من الإبرة (على سبيل المثال، عن طريق دخول الجنين بعمق شديد)، أو ربما تم إخراج الخلايا بقوة كبيرة. ويمكن أن ينتج تأخر السمية والوفاة الجنينية أيضا عن صفار أو حطام خلايا حقن مع الخلايا المانحة؛ يمكن أن يكون سبب آخر تدهور HEPES المخزن المؤقت في الحل Ringer. يمكن التغلب على هذه المشاكل عن طريق غسل الخلايا (انظر الخطوة 1.3.8) أو ببساطة باستخدام دفعة جديدة من المخزن المؤقت، على التوالي. وعلاوة على ذلك، قد تنتج الأجنة المضيفة المشوهة في تجارب زرع الجرثومة عن تركيزات مورفولينو عالية للغاية. من الأهمية بمكان استخدام ما يكفي من مورفولينو لإبطال الجرثومة البرية للمضيف بشكل كامل ، وبالتالي منع هذه الخلايا من المساهمة في النسل - ولكن في الوقت نفسه ، يجب تجنب تركيزات مورفولينو العالية بشكل مفرط. ولذلك فإن كميات المورفولينو المتسقة عبر جميع الأجنة المضيفة المحقونة (بضع مئات في تجربة نموذجية) هي المفتاح لنجاح عمليات زرع الجراثيم. ويمكن مساعدة هذا عن طريق استكمال مزيج حقن مورفولينو مع dye14 التتبع مرئية بسهولة, والتي يمكن تعقبها تحت مجسم مفلورة لضمان أن جميع الأجنة تلقي نفس حجم الحقن.
تتضمن الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول حصريا التلاعب بالخلايا في أجنة حمار وحشي أو ميداكا في مرحلة blastula ، ولكن في المستقبل ، من المرجح أن يكون من الممكن تكييف الجهاز مع مراحل وأنواع مختلفة عن طريق تغيير قطر وشكل إبرة الزرع.

من التجارب الكلاسيكية مانغولد وسبيمان التي أظهرت وجود منظم تعليمات تشكيل محور الجنين1، زرع الخلايا بين الأجنة أصبح تقنية راسخة لدراسة التطور الجنيني2،3،4،5،6،7،8،9،10 . ويتكون الإعداد الشائع الاستخدام للزرع من حقنة ضيقة بالغاز يتم التحكم فيها بواسطة ميكرومتر متصلة بحامل ميكروبايت من خلال أنابيب مرنة وخزان مليء بالزيت المعدني12,13. في هذا الإعداد، يتم نقل المكبس من الحقنة من خلال المسمار. يتم نقل الضغط المتولد بهذه الطريقة إلى الميكروباينيت ويستخدم لسحب الخلايا من جنين واحد وإيداعها في جنين آخر. ومع ذلك، يتكون هذا الجهاز الذي يعمل هيدروليكيا من أجزاء كثيرة وشاقة لتجميع من الصفر. ويمكن أيضا شراء أجهزة مماثلة كجهاز عمل كامل ، وعادة ما تباع كمقنات دقيقة يدوية ، وتكلف هذه الإصدارات التجارية عادة أكثر من 1500 دولار أمريكي. في كل من النسخة المنزلية والتجارية ، يتم فصل micropipette للتلاعب الجنين من الجهاز توليد الضغط (حقنة الغاز ضيق) من خلال أنابيب مملوءة بالنفط. التلاعب في micropipette وحركة المكبس ، لذلك ، يجب أن تعمل بشكل منفصل مع أيدي مختلفة ، والحد من الإنتاجية والفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن الأجهزة مرهقة للتحضير لزرع منذ أنابيب يحتاج إلى أن تكون مليئة بعناية مع النفط مع تجنب تشكيل فقاعات. هنا، نقوم بوصف جهاز بديل يعمل بالهواء المضغوط لإزالة الخلايا وزرعها غير مكلف وسهل التجميع وبسيط الاستخدام.
الجهاز المعروض هنا يتكون من 25 ميكرولتر الغاز ضيق حقنة مزودة حامل micropipette وتكاليف أقل من 80 دولارا أمريكيا تماما. يتم تجميع الجهاز بسهولة عن طريق إدخال حامل micropipette في الحقنة عن طريق تركيب قفل Luer (الشكل 1A). ثم يتم تركيب الجهاز مباشرة على ميكرومانيبولاتور، مما يسمح للمستخدم بالتحكم في كل من موقعه والشفط بيد واحدة مباشرة في المايكرومانيبولاتور. هذا يترك اليد الأخرى حرة لتحقيق الاستقرار ونقل طبق زرع تحتوي على الأجنة المانحة والمضيف. يعمل الجهاز عن طريق الشفط المباشر بالهواء ولا يحتاج إلى ملء بالزيوت المعدنية. نظرا للقوى الجذابة بين الماء وجدران الإبرة الزجاجية ، تترجم حركة كبيرة في المكبس للمحقنة إلى حركة أصغر في مستوى الماء داخل الإبرة ، طالما أن مستوى الماء في النهاية المدببة لل إبرة الزجاج. وهذا يسمح بالتحكم الدقيق في عدد الخلايا المهتتة وموقع إدراجها.
لإثبات فائدة هذا الجهاز، نقدم ثلاثة تطبيقات في أجنة حمار وحشي (دانيو ريو). أولا، نعرض كيفية توليد مصادر مترجمة لجزيئات الإشارات المفرزة، والتي يمكن استخدامها لدراسة تشكيل التدرج2،4،6. هنا، يتم حقن الأجنة المانحة مع مرنا ترميز جزيء إشارة المسمى الفلورسنت. ثم يتم زرع الخلايا المانحة المسماة بالفلورسينس إلى أجنة مضيفة من النوع البري حيث يمكن تصوير تكوين تدرج الإشارة وتحليله. ثانيا، نحن نصف كيف يمكن استخدام الجهاز لإزالة الخلايا عن طريق الخلع من أجل توليد الأجنة ذات الحجم المنخفض5،13. وأخيرا، نظهر كيفية إنتاج المسوخ الأم الزيجوتية بقوة عن طريق زرع خلايا تحمل مراسل الخلايا الجرثومية البدائية في الأجنة المضيفة التي تم فيها استئصال الخط الجرثومي 6,10. في المستقبل، يمكن تكييف جهاز الزرع الموصوف هنا بسهولة مع التلاعبات الجنينية الأخرى التي تتطلب إزالة أو زرع الخلايا.

<table><tbody><tr><td>1.0 مم زجاج شعري ، نهايات مقطوعة بدون خيوط</td><td></td><td></td><td>لجعل إبرة الزرع</td></tr> شعرية <tr><td>زجاجية 1.0 مم ، نهايات مقطوعة بخيوط</td><td></td><td></td><td>لصنع إبر الحقن</td></tr><tr><td>200 مل دورق</td><td></td><td></td> زجاجي <td>لتفكيك الأجنة</td></tr><tr><td>صفيحة</td><td></td><td></td> بلاستيكية 24 بئر <td>ليتم طلاؤها بالأغروز من أجل احتضان الأجنة</td></tr><tr><td>طبق بتري زجاجي بقطر 5 سم</td><td>لتفكيك الأجنة</td>صفيحة بلاستيكية 6 آبار ليتم تغطيتها بالأغروز من أجل احتضان الأجنة Agarose لتغليف الأطباق البلاستيكية dnd1 تسلسل أدوات الجينات مورفولينو: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT وسط الجنين <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>250 مجم / لتر ملح المحيط الفوري ، 1 مجم / لتر من الميثيلين الأزرق في ماء التناضح العكسي المعدل إلى درجة الحموضة 7 مع مجهر مجسم NaHCOsub3</td></tr> <tr><td>مع مرشحات GFP / RFP ومصدر</td><td></td><td></td> الضوء <td>لتقييم حقن YSL وزرع الخط الجرثومي</td></tr><tr><td>مجتذب الماصة الدقيقة الزجاجية</td><td>شركة Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td>لصنع إبرة الزرع</td></tr><tr><td>ماصة</td> <td>باستور زجاجيةكيمبل تشيس (عبر فيشر)</td> <td>63A53WT</td><td>لسحب الأجنة ؛ يمكن أن تكون ملتهبة الأطراف لتنعيم</td></tr><tr><td>حاضنة الحافة عند 28 درجة ؛ C</td><td></td><td></td><td>لاحتضان أجنة الزرد طرف</td></tr><tr><td>Luer 25 & mu ؛ L حقنة هاميلتون ، سلسلة 1700</td><td>هاميلتون</td><td>المرجع: 80201</td><td>جزء من جهاز الزرع</td></tr><tr><td>مناور دقيق يدوي مع 3 محاور للحركة</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>للتحكم في جهاز الزرع</td></tr><tr><td>مضخة سحب العينات اليدوية</td><td>Bio-Tek</td><td>Cat. # 641</td><td>للاستخدام مع الماصات الزجاجية لنقل الأجنة مسبار</td></tr><tr><td></td><td></td><td>تشريح المعادن</td><td>للتحرك والدوران أجنة الزرد</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF2</td><td>لصنع إبرة الزرع</td></tr><tr>جهاز <td></td><td></td><td>الحقن المجهري</td><td>لحقن mRNA و morpholino في الأجنة قوالب</td></tr><tr><td>الحقن المجهري ، الأخاديد المثلثة</td><td>أدوات العلوم التكيفية</td><td>TU-1</td><td>لإعداد ألواح الحقن المجهري مع قوالب الحقن</td></tr><tr><td>المجهري ، الآبار المفردة</td><td>أدوات العلوم التكيفية</td><td>PT-1</td><td>لتحضير ألواح الزرع بحامل الماصة الدقيقة الاغاروز</td></tr><tr><td>مع تركيب Luer لأدوات الدقة العالمية الشعرية الزجاجية مقاس 1.0 مم</td><td></td><td>MPH6S10</td><td>جزء من جهاز الزرع</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 مجموعة النسخ</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340M</td><td>لتوليد mRNA مقبوع للحقن في الأجنة</td></tr><tr><td>البلازميد باستخدام GFP-nos1 3'UTR </td><td></td><td></td><td>البلازميد الذي يمكن نسخه لإنتاج mRNA مشفر GFP مع 3'UTR من nos1 طبق</td></tr> <tr><td>بتري بلاستيكي 100 مم</td><td></td><td></td><td>ليتم تغطيته بالأغروز من أجل صنع أطباق الحقن والزرع</td></tr><tr><td>البروتياز من Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>لتفكيك الأجنة: اصنع مخزونا 5 مجم / مل واستخدمه عند 1 مجم / مل لإزالة الأجنة</td></tr><tr><td>من Ringer محلول</td><td></td><td></td><td>s ل 1 لتر: أضف 6.78 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.22 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.26 جم من كلوريد المكالسيوم < الفرعي >2 < / فرعي > و 1.19 جم من HEPES ؛ ثم املأ إلى 1 لتر ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 ؛ تعقيم بالترشيح</td></tr><tr><td>مجهر</td><td></td><td></td> مجسم <td>للحقن والزرع</td></tr></tbody></table>

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

إن التلاعبات الجنينية الكلاسيكية، مثل إزالة الخلايا وزرع الخلايا داخل الأجنة أو بينها، هي تقنيات قوية لدراسة عمليات النمو المعقدة. تعد أجنة سمك الحمار الوحشي مناسبة بشكل مثالي لهذه التلاعبات نظرا لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة ، وكبيرة نسبيا في الحجم ، وشفافة. ومع ذلك ، فإن الأجهزة التي تم تطويرها سابقا لإزالة الخلايا وزرعها مرهقة للاستخدام أو مكلفة للشراء. في المقابل ، فإن جهاز الزرع المعروض هنا اقتصادي وسهل التجميع وبسيط الاستخدام. في هذا البروتوكول، نقدم أولا التعامل مع جهاز الزرع وكذلك تجميعه من الأجزاء المتاحة تجاريا وعلى نطاق واسع. ثم نقدم ثلاثة تطبيقات لاستخدامها: توليد الحيوانات المستنسخة خارج الرحم لدراسة تشتت الإشارات من مصادر موضعية، وتجث الخلايا لإنتاج أجنة منخفضة الحجم، وزرع الجرثومة لتوليد المسوخ الأم الزيجوتية. وأخيرا، نظهر أن الأداة يمكن أن تستخدم أيضا للتلاعب الجنيني في أنواع أخرى مثل ميداكا أسماك الأرز اليابانية.

النجاح والفشل في استخدام جهاز زرع للتطبيقات الثلاثة المذكورة أعلاه يمكن بسهولة تقييمها عن طريق الفحص البصري تحت منظار مجسم. في عمليات الزرع الناجحة ، يجب أن يبدو الجنين طبيعيا ومشابها في الشكل ووضوح الصفار للأجنة غير المخططة ، دون دموع كبيرة في blastoderm. إذا كان الجنين معطوبا بشكل واضح (الشكل 4B) ، فلن يتطور بشكل طبيعي. من الناحية المثالية، يجب أن تظهر الخلايا المزروعة التي تعبر عن علامة فلورية كأعمدة مستمرة عند النظر إليها تحت منظار مجسم مفلور (الشكل 2A، الشكل 4A). إذا كان العمود مجزأ، فهذا يشير إلى أن الخلايا تم قصها بواسطة الشفط إلى إبرة الزرع أو أن ترسب الخلايا تم بقوة كبيرة. ويمكن منع ذلك عن طريق تحريك المكبس ببطء وبلطف.
على الرغم من أن جهاز زرع قد استخدمت أساسا على أجنة حمار وحشي في مراحل blastula5,6, زرع و استئصال الخلايا العمل فقط كذلك لأجنة مرحلة blastula dechorionated من ميداكا سمك الأرز الياباني (Oryzias latipes) (الشكل 2B). وبصرف النظر عن dechorionation الجنين، الذي وصفه Porazinski، S. R. وآخرون.17، يمكن اتباع نفس الإجراءات كما هو موضح أعلاه.
في حالة زرع الجرثومة على وجه التحديد، فإن عملية زرع جيدة تؤدي إلى جنين مع عمود أفقي طويل من الخلايا مباشرة فوق هامش صفار (الشكل 4A). ومع ذلك، لا يمكن تقييم ما إذا كانت الخلايا الجرثومية قد تمت زراعتها بنجاح إلا في اليوم التالي (الشكل 4C-F) بسبب التعبير الخلفي عن GFP في مراحل blastula (الشكل 1F). ستظهر الخلايا الجرثومية البدائية كمجالات فلورية صغيرة في الأخدود مباشرة فوق امتداد الصفار (الشكل 4C-E). وجود هذه الخلايا في الموقع الصحيح يشير إلى نجاح زرع الجرثومة. الخلايا ذات الشكل المختلف ليست خلايا جرثومية (على سبيل المثال، الخلايا الممدودة هي عادة خلايا عضلية، الشكل 4F). أيضا، إذا تم العثور على الخلايا الجرثومية البدائية خارج الأخدود، وهذا يعني أنها فشلت في الهجرة بشكل صحيح، وأنها لن تكون قادرة على المساهمة في الجرثومة الجنين. وأخيرا، ينبغي أن يظهر الشكل العام للأجنة المزروعة على غرار الأجنة غير المزروعة (الشكل 4D)؛ لا ينبغي أن يكون مشوه الذيل، وينبغي أن لا يكون الرأس تقلصت أو في عداد المفقودين عيون (الشكل 4E). هذه العيوب تنتج عموما من تركيزات مورفولينو عالية بشكل مفرط أو من تلف الجنين أثناء زرع. عادة ما تؤدي تجارب زرع الجراثيم كما هو موضح هنا إلى 1-2 من أصل 6 أجنة مضيفة مع خلايا جرثومية تم زرعها بنجاح ل 60٪ -80٪ من الأجنة المانحة ، اعتمادا على تجربة المجرب. وهكذا، تحتاج الخلايا من 40-50 جنينا مانحا متجانسا إلى زرعها في 200-300 جنين مضيف لتربية ما يقرب من 30 فردا يعانون من خلايا جرثومية متحولة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> الشكل 1: تجميع واستخدام جهاز الزرع. (أ) يتم تجميع جهاز الزرع عن طريق توصيل حقنة ضيقة بالغاز مع حامل micropipette من خلال تركيب قفل Luer. ثم يتم إدخال الإبرة الزجاجية لزرعها في حامل المايكروبايت. (ب) صورة لجهاز زرع تجميعها محمولة على micromanipulator (يرجى ملاحظة أن الخلفية والتسميات قد أزيلت من الصورة). (ج) عند استخدام جهاز الزرع، من المهم التأكد من أن مستوى الماء في إبرة الزرع يبقى في النهاية مدبب. (د) يستخدم الجهاز تحت منظار مجسم لسحب وإدخال خلايا من الأجنة عن بعد ووضعها في آبار فردية من طبق زرع. (ه) بالنسبة لتوليد المصادر خارج الرحم، تؤخذ الخلايا من القطب الحيواني للجنين المتبرع (i-ii) وتنقل إلى القطب الحيواني للجنين المضيف (III-vi). (و) بالنسبة لزرع الجرثومة، يؤخذ عدد أكبر من الخلايا من هامش الجنين المتبرع (i-ii)، حيث توجد الخلايا الجرثومية. ثم يتم نقل الخلايا إلى هامش الأجنة المضيفة (III-vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> الشكل 2: توليد استنساخ عن طريق زرع الخلايا. (أ) مثال على استنساخ مزدوج يولده زرع متسلسل للخلايا الفلورية (الخضراء) من متبرع حمار وحشي إلى جنين مضيف لسمك الحمار الوحشي. ويمكن استخدام المستنسخين الفرديين والمزدوجين لدراسة كيفية تشكل جزيئات الإشارات المفرزة تدرجات ندواتية2,4,5,6. (ب) مثال على استنساخ واحد تم إنشاؤه عن طريق زرع خلايا من متبرع ميداكا (Wimbledon) عبر عن eGFP معدل وراثيا (Wimbledon)17 في مضيف ميداكا من النوع البري. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> الشكل 3: توليد أجنة مخفضة الحجم عن طريق استئصال الخلايا. (أ) قبل إزالة الخلايا عن طريق الاستئصال ، يمكن تسمية YSL عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في جانبين متعارضين من YSL. (ب) مثال على الجنين بعد حقن YSL. (ج) لتوليد الأجنة التي تقلص حجمها، تتم إزالة الخلايا من القطب الحيواني عن طريق extirpation5. (د) مثال على جنين بعد استئصال الخلايا. لاحظ أن YSL يبقى سليما. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> الشكل 4: زرع الجرثومة. (أ) مثال على نجاح زرع الخلايا المانحة (الخضراء) في المنطقة الهامشية للمضيف. (ب) مثال على عملية زرع غير ناجحة. أصيب صفار الجنين المضيف بأضرار بالغة، ولن يتمكن الجنين من النمو بشكل طبيعي. (ج) في 30 حصان، سيتم العثور على الخلايا الجرثومية المزروعة بنجاح فقط في ميسوديرم غدد الغدد التناسلية في المنطقة الأمامية من تمديد صفار. (د) مثال على عملية زرع ناجحة قامت فيها عدة خلايا جرثومية مانحة تحمل اسم GFP بملء الننض المستقبلي للمضيف. (ه) مثال على عملية زرع غير ناجحة. على الرغم من أن الخلايا الجرثومية قد وصلت إلى ميسودرم غدد الغدد التناسلية، إلا أن الجنين المضيف مشوه بشدة ولن يتطور بشكل طبيعي. (و) مثال على عملية زرع غير ناجحة. الخلايا الجرثومية الفلورية التي فشلت في الهجرة إلى الموقع الصحيح لن تعيد إسكان النواد. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. تم التقاط الصور في D-F في التكبير الكلي من حوالي 50x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

تعد التلاعبات الجنينية مثل استئصال الخلايا وزرعها أدوات مهمة لدراسة التطور المبكر. يصف هذا البروتوكول جهاز زرع بسيط وفعال لإجراء هذه التلاعبات في أجنة حمار وحشي.

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

تمكن هذه التقنية من دراسة وظيفة ونطاق جزيئات الإشارات أثناء تكوين الجنين عن طريق زرع مصادر الإشارات خارج الرحم. كما أنه يسهل توليد كفاءة من المسوخ الجرثومية. يمكن تطبيق البروتوكول على خشبة البحر الوحشي المرحلة blastula وأجنة ميداكا، وربما أيضا إلى المراحل الجنينية الأخرى والأنواع TDO.لتجميع جهاز زرع، وربط تلميح إغراء 25 ميكرولتر الغاز حقنة ضيقة لحامل ماصة صغيرة باستخدام تركيب قفل إغراء. ثم قم بتركيب الجهاز مباشرة على مناور صغير يدوي. لاستخدام جهاز الزرع، ضع المتلاعب الصغير مع الجهاز المجمع بجوار مجهر ستيريو.ثم إزالة المكبس وإدراج إبرة زرع. خفض الإبرة في طبق مملوء محلول رينغر في زاوية 45 درجة حتى يتم غمر غيض من الإبرة. أدخل المكبس في منتصف الطريق تقريبا لطرد حلول Ringer ، تاركا كمية صغيرة فقط من الماء في الجزء الرقيق من الإبرة.عند استخدام إبرة زرع للمرة الأولى، معطف داخل الإبرة عن طريق رسم نير من الجنين التضحية وطرد المواد نير تماما. بعد ذلك ، باستخدام إبرة زرع ، ضع الجنين المتبرع برفق ، ثم ضع الإبرة التي تفتح متعامدة على سطح الجنين واسحب المكبس بعناية لرسم الخلايا في الإبرة. بمجرد سحب العدد المطلوب من الخلايا ، أوقف الشفط عن طريق دفع المكبس برفق إلى الأسفل وإزالة الإبرة من الجنين عن طريق الرجيج الإبرة إلى الجانب في حركة قصيرة وسريعة.اترك محلول Ringer على جانبي عمود الخلية عن طريق تقييد الخلايا إلى نهاية الإبرة المدببة. مسح أي صفار المتبقية أو حطام الخلية عن طريق تحريك ببطء المكبس صعودا وهبوطا وغسل الخلايا مع محلول رينغر. بعد ذلك ، قم بتحريك طبق الزرع بيد غير مهيمنة لوضع الإبرة المتعامدة على سطح الجنين المضيف.تطبيق ضغط طفيف على الجنين عن طريق الضغط بعناية على الجدران. ثم مع حركة حادة سريعة ، اخترق الطبقة المغلفة للجنين المضيف مع الحرص على عدم خدش الصفار بالإبرة. بمجرد أن تدخل الإبرة ، ادفع المكبس برفق لقذف عمود الخلايا في الجنين ، وتراجع الإبرة ببطء في وقت واحد.لزرع الخلايا الجرثومية، وملء طبق زرع مع محلول رينغر، ثم نقل الكرة dechorionated إلى الأجنة مرحلة القبة في طبق زرع ووضع الأجنة المضيف والمانح في أعمدة بالتناوب لزرع الخلايا من جنين متبرع واحد إلى ستة أجنة مضيفة مختلفة. لتنفيذ عملية الزرع، توجيه الأجنة مع الهامش نحو إبرة زرع. لزرع الجرثومة، خذ الخلايا المصدر من الهامش وأودعها في نفس الموقع في الجنين المضيف.بمجرد الانتهاء من عملية الزرع، اسمح للجنين بالتعافي في محلول رينغر لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. ثم باستخدام مجهر ستيريو مضان، فحص الخلايا المزروعة. بعد ذلك ، نقل الأجنة إلى 24 طبق مغلفة Agarose جيدا مع الجنين المتوسط تجميع جميع الأجنة المضيفة التي تلقت خلايا من نفس المتبرع في نفس البئر.ثم احتضان الأجنة في 28 درجة مئوية حتى اليوم التالي. إذا لزم الأمر، نقل الأجنة المانحة إلى شرائط PCR المسمى لل genotyping. بعد 30 ساعة من الإخصاب، قم بفحص الأجنة المضيفة لإجراء عمليات زرع الجرثومة الناجحة تحت مجهر ستيريو مضان.يجب أن تكون الخلايا الجرثومية موجودة في الأخدود فوق امتداد الصفار. زراعة اليرقة المزروعة بنجاح إلى غطاء محرك السيارة للبالغين وفقا لظروف تربية قياسية. في عمليات الزرع الناجحة ، يبدو الجنين طبيعيا ومشابها في الشكل ووضوح الصفار للأجنة غير المخططة دون دموع كبيرة في blastoderm.في المقابل، إذا كان الجنين معطوبا بشكل واضح أثناء الزرع، فلن يتطور بشكل طبيعي. على الرغم من أن جهاز الزرع قد استخدم بشكل رئيسي على أجنة حمار وحشي في مراحل blastula ، إلا أنه يمكن أيضا إجراء الزرع وإزالة الخلايا في أجنة مرحلة blastula dechorionated من ميداكا سمك الأرز الياباني. في حالة زرع الجرثومة على وجه التحديد ، ينتج عن زرع جيد جنين مع عمود أفقي طويل من الخلايا فوق هامش الصفار مباشرة.ومع ذلك ، لا يمكن تقييم نجاح الإجراء إلا بعد 24 إلى 30 ساعة من الإخصاب عندما تكون الخلايا الجرثومية متميزة في مضانها عن الخلايا الجسدية. ستظهر الخلايا الجرثومية البدائية كمجالات فلورية صغيرة في الأخدود مباشرة فوق امتداد الصفار. وجود هذه الخلايا الجرثومية في الموقع الصحيح يشير إلى نجاح زرع الجرثومة.وترد هنا أمثلة على عمليات زرع غير ناجحة. في المثال الأول ، على الرغم من أن الخلايا الجرثومية قد وصلت إلى ميسودرم غدد الغدد التناسلية ، حيث أن الجنين المضيف مشوه بشدة ، إلا أنه لن يتطور بشكل طبيعي. في المثال الثاني، يتم الكشف عن الخلايا الفلورية فقط خارج الأخدود.هذه الخلايا هي إما خلايا جسدية أو خلايا جرثومية فشلت في الهجرة بشكل صحيح. وكلا النوعين من الخلايا لن يساهم في الخط الجرثومي للجنين. من المهم تجنب تلف الخلايا المزروعة والجنين المضيف.يجب رسم الخلايا ببطء، وتطهيرها من أي صفار المتبقية، ويتم إدراجها بعناية. توفر هذه الطريقة طريقة سهلة لزرع الخلايا في أجنة حمار وحشي ، وستكون مفيدة لتوليد مصادر خارج الرحم ومسوخ الجرثومة. الميزة الرئيسية لهذا الجهاز، فمن تكلفة منخفضة، والكثير ويستخدم.

a-simple-and-effective-transplantation-device-for-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

دليل خطوة بخطوة لتوليد اجنة استهدفت الزرد خيالية بواسطة زرع في المرحلة الأريمة أو المعيدة.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

الزرد زرع الخلايا يمكن الجمع بين علم الوراثة وعلم الأجنة لتوليد نسيج الوهم محددة. هذا الفيديو يوضح المعيدة نظموا زرع الخلية التي سمحت مختبرنا للتحقيق في دور السكان astroglial والعظة توجيهات محددة خلال تشكيل الصوار في الدماغ المقدم.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

ندلل على بروتوكول لتوليد اجنة الزرد خيالية للسلوك التصوير العيش الخلوية خلال مرحلة التطور الجنيني.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا ممتازا للدراسات الجينية والتنموية. زرع الخرزة هو تقنية قيمة لمعالجة الأنسجة يمكن استخدامها لاستجواب آليات النمو عن طريق إدخال تغييرات في البيئات الخلوية المحلية. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء زرع الميكروبيدات في جنين الزرد.

Microbead زرع الأجنة الزرد

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.

طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة

نقدم هنا بروتوكولا لزرع الخلايا بدقة مكانية وزمانية عالية في أجنة الزرد واليرقات في أي مرحلة بين 1 و 7 أيام على الأقل بعد الإخصاب.

زرع الخلايا عالية الدقة في الزرد الجنيني واليرقات

اكتشف تقنية زرع الخلايا في أجنة سمك الزرد لدراسة جزيئات الإشارة أثناء تخلق الأجنة. تُسهّل هذه الطريقة إنشاء طفرات خطية جرثومية بكفاءة عالية.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

استكشف المزيد من الفيديوهات