A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

يوفر المقايسة المغذية microplate طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية واقتصادية لقياس سلوك تغذية Drosophila ، وتوفر مزايا متعددة على الطرق الأخرى الأكثر تفصيلا. إن قياس الاستهلاك عن طريق قياس الامتصاص باستخدام قارئ لوحة يلغي القياسات اليدوية ويستبعد إدخال البيانات اليدوية. البيانات قابلة أيضا لاستخراج البرامج ومعالجتها.

مع هذا المقايسة عالية الإنتاجية يمكننا تحديد استهلاك المواد الغذائية القابلة للذوبان في الماء ، والأدوية ، والمستحضرات الصيدلانية ، أو السموم ، ويمكن تعديل النظام للتطبيقات على مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات. تبدأ بصب agarose المنصهر في الحوض الصغير كاشف والاستغناء عن 80 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر في كل بئر من لوحة صغيرة 96 جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بتبريد بقايا الآغاروز لمدة تصل إلى أسبوع في كيس مختوم وقم بإعادة تهييحها لصنع أطباق إضافية.

إذا كانت شرائط الحاجز فضفاضة جدا، لف لهم حول الإصبع لمنحهم انحناء لعقد لهم في القنوات. أدخل شرائط الحاجز في قنوات الشريط الحاجز لإعداد الزوجين. لصق الزوجين إلى لوحة المجاعة، والتأكد من عدم استخدام الزوجة للتلاعب لوحة كما قد تنزلق الزوجين قبالة.

تأكد من أن الزاوية الزاوية للمنبر تتطابق مع الزاوية الزاوية للاللوحة الدقيقة للحفاظ على الاتجاه الصحيح. تحت تخدير ثاني أكسيد الكربون، قم بفرز الذباب الذي تفرزه من ثلاثة إلى خمسة أيام. تحميل الذباب الفردية عن طريق العمود في لوحة المجاعة.

أغلق كل عمود أثناء تعبئته عن طريق ضبط شريط الحاجز الخاص به إلى الموضع المغلق. سجل تخطيط العينة بعناية داخل اللوحة الدقيقة. بمجرد ملء لوحة المجاعة ، اسمح للذباب بالتعافي تلقائيا بعد إزالة ثاني أكسيد الكربون ، وتجويعه لمدة ست ساعات بدءا من وقت تخديره الأولي.

إعداد 10 ملليلتر من المواد الغذائية السائلة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر عن طريق حل 0.4 غرام من السكروز و 0.1 غرام من استخراج الخميرة في 10 ملليلتر من الماء المقطر. دوامة الأنبوب حتى تذوب المواد الصلبة تماما. إضافة 40 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة ونقل الطعام السائل إلى حقنة 10 ملليلتر يميل مع مرشح 0.45 ميكرومتر.

فلتر ما يقرب من 1.5 ملليلتر من المحلول في كل مرة إلى أنبوب 1.7 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. وضع المحقنة التي تحتوي على الحل جانبا وتصفية محلول إضافي حسب الحاجة أثناء إعداد لوحة التغذية. إعداد لوحة التغذية عن طريق ختم الجزء السفلي من لوحة صغيرة 1536 جيدا مع فيلم الختم.

استخدام مجداف الختم على الالتزام الفيلم بدقة. ثم، تقليم الفيلم الزائد قبالة الحواف اليسرى واليمينية مع شفرة حلاقة. الاستغناء عن 10 ميكرولترات من المواد الغذائية السائلة المصفاة العمود الحكيم في البئر الأيسر العلوي لكل مجموعة من أربعة آبار من 1536-جيدا microplate.

بمجرد ملء جميع الآبار ، ضع فيلم ختم على الجزء العلوي من اللوحة ، باتباع نفس الخطوات المستخدمة لختم الجزء السفلي من اللوحة الدقيقة. كرر لعدد المطلوب من لوحات. طرد مركزي لوحات في 200 مرة G لمدة 10 ثوان لتسوية السائل.

لا تسمح بتبريد اللوحة لأن هذا يمكن أن يسبب تراكم التكثيف في الآبار ، مما يحجب قراءات الامتصاص. ثقب الآبار على السطح العلوي من لوحة مع أداة التحقيق إبرة مجهزة إبرة قطرها 0.25 ملليمتر، وذلك باستخدام نفس الترتيب لثقب كما كان يستخدم عند الاستغناء عن الحلول. مسح الإبرة بين الحلول لمنع التلوث المتبادل.

الوجه لوحة وثقب الآبار في الجزء السفلي. قراءة امتصاص لوحة في 630 نانومتر دون غطاء. ضع غطاء داخليا على فيلم الختم العلوي لضمان أن حلقات التكثيف تطوق الآبار المثقبة ، ثم ضع الغطاء الخارجي على اللوحة.

ضع وجه لوحة التغذية على المنافر بحيث تقوم الأدلة بمحاذاة الثقوب المناسبة للوحة التغذية ولوحة المجاعة. تأكد من أن المنافر واللوحات موجهة بشكل صحيح. بمجرد تحميل جميع لوحات التغذية على الزوجين، افتح الآبار للوحات عن طريق ضبط شرائط الحاجز على الزوجين.

ضع تجميعات المناصفة واللوحة في الحاوية الثانوية. ضع النصف السفلي من صندوق ماصة يحتوي على مناشف ورقية منقوعة في كل حاوية ثانوية لتوفير الرطوبة. أغلق غطاء الحاوية الثانوية ونقلها إلى بيئة خاضعة للرقابة.

السماح للذباب تستهلك لمدة 22 ساعة. بعد 22 ساعة من التعرض، تحقق من كل لوحة للذباب الميت وتحديث تخطيط لوحة وفقا لذلك. بعد فحص جميع اللوحات ، تخدير الذباب بشكل جماعي عن طريق ضخ ثاني أكسيد الكربون داخل الحاوية الثانوية.

بعد حوالي 60 ثانية، تأكد من أن جميع الذباب معطل. اضغط برفق الذباب في لوحة المجاعة واستبدال شرائط الحاجز البلاستيكي. قم بإزالة لوحات التغذية للقراءة.

إعادة قراءة امتصاص اللوحة في 630 نانومتر. كرر العملية حتى يتم قراءة جميع اللوحات. تم قياس التبخر كميا لكل بئر ووجد لتحديد ما إذا كانت هناك أي ارتباطات بين آبار اللوحات الفردية.

تم حساب معاملات ارتباط بيرسون للتبخر مقابل الصفوف والتبخر مقابل الأعمدة لتقييم الاتجاهات بين التبخر ومواقع الآبار. وتم تحديد استهلاك ذباب كانتون - س. س. الذي يبلغ عمره ثلاثة إلى خمسة أيام لتحديد صحة البروتوكول. أعطيت الذباب الاختيار بين محلول السكروز 4٪ مع استخراج الخميرة 1٪ ومحلول السكروز 4٪ تكملها مع 15٪ الإيثانول و 1٪ استخراج الخميرة.

وأظهرت كل من الذكور والإناث تفضيل ساحق للحل مع الإيثانول واستخراج الخميرة. من الضروري الحفاظ على الاتساق عند بناء لوحات التغذية ، وضمان تقديم كل ذبابة مع سيناريو استهلاك مماثل فيما يتعلق بحجم الطعام والتبخر والوصول. ستسمح هذه التقنية للباحثين في مجال Drosophila بإجراء فحوصات عالية الإنتاجية لسلوكيات الاستهلاك والتفضيل ذات الإنتاجية العالية وبتكلفة أقل مقارنة بالطرق التقليدية.