Name: إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: تعلم إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية لدراسة هياكل البروتينات بتقنية cryo-EM. يُظهر هذا البروتوكول كيفية تجميد العينات عند 70 درجة مئوية لفهم تأثيرات الحرارة على الوظائف البيولوجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون الدكتور هيرفي ريميجي من Thermo Fisher Scientific على المشورة المفيدة. تم إجراء تجارب cryo-EM في منشأة Academia Sinica Cryo-EM (ASCEM). يتم دعم ASCEM من قبل Academia Sinica (رقم المنحة. AS-CFII-108-110) ومشروع تايوان للبروتين (رقم المنحة. AS-KPQ-109-TPP2). كما يشكر المؤلفون السيدة هوي - جو هوانغ على المساعدة التي قدمتها في إعداد العينة.

ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام جهاز تزجيج تجاري معدل لإعداد عينات المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) في درجات حرارة محددة، وخاصة أعلى من 37 درجة مئوية. يظهر الإعداد التجريبي العام في الشكل 1. يستخدم البروتوكول 55 درجة مئوية كمثال. للاطلاع على الظروف المحددة في درجات الحرارة الأخرى، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 2 في المرجع12.
1. إعداد جهاز التزجيج
<ol><li>قم بعمل ثقب 1 سم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل في نهايته المغلقة.</li>
	<li>ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية ، كما هو موضح في الشكل 2. ملاحظة: الغرض من ذلك هو تقليل تكثيف الماء عن طريق توجيه بخار الماء إلى المبادل الحراري عبر الأنبوب قبل الوصول إلى الغرفة بأكملها.</li>
	<li>قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة (على سبيل المثال ، 55 درجة مئوية ، كما هو موضح في الشكل 3) ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة.</li>
</ol>2. تسخين العينة والأدوات
<ol><li>ضع الحمام المائي على صفيحة موقد واضبط الموقد على درجة الحرارة المطلوبة (هنا 55 درجة مئوية). تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية.</li>
	<li>احتضن العينة في الحمام المائي وقم بتسخين طرف الماصة مسبقا على حافة السخان لمدة 2 دقيقة أو أكثر قبل تجربة النشاف. ملاحظة: أعلى إعداد لدرجة الحرارة لغرفة جهاز التزجيج هو 60 درجة مئوية. لإعداد شبكات درجة حرارة أعلى لتجربة cyro-EM (على سبيل المثال ، 70 درجة مئوية) ، يتم تحضين العينة في الحمام المائي عند 80 درجة مئوية ، ويقدر المتوسط بين درجة حرارة العينة ودرجة حرارة جهاز التزجيج بأنه درجة الحرارة الفعلية للعينة على الشبكة (70 درجة مئوية في هذه الحالة). انظر قسم المناقشة للحصول على مزيد من التفاصيل والقيود على هذا التقدير.</li>
</ol>3. التحضير لتجربة النشاف
<ol><li>قم بتفريغ شبكة مدعومة بالكربون عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية ، أو بديل للقيم اعتمادا على الجهاز المستخدم.</li>
	<li>احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة 2 دقيقة أو أكثر.</li>
	<li>املأ حاوية الإيثان بالإيثان وفقا للإجراءات القياسية. لا تدع الإيثان يفيض. ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة حوالي 10 دقائق ويجب اتباعها على الفور مع تجربة النشاف لتجنب التجميد.</li>
	<li>ضع ورقة تصفية التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز 5 دقائق قبل تجربة النشاف. ملاحظة: سيؤدي وضع ورقة الترشيح في الغرفة في وقت مبكر جدا إلى أن تصبح رطبة جدا.</li>
</ol>4. تجربة اللطخة
ملاحظة: عند الإمساك بالشبكة ، تأكد من أن الشبكة مستقرة وأن هناك الحد الأدنى من منطقة التلامس مع الملقط (الشكل 4). يتم ذلك للحفاظ على أفضل كفاءة تبريد للإيثان وتجنب الجليد غير الزجاجي.
<ol><li>استخدم طرف ماصة لتطبيق 7-9 ميكرولتر من العينة على الشبكة. ثم انتظر 1-2 ثانية ، ولطخ لمدة 1-1.5 ثانية ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل.</li>
	<li>انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد ، الذي يتم تخزينه في النيتروجين السائل. ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية فائقة لأن الملقط لا يزال ساخنا ، وبالتالي فإن خزان التبريد بأكمله مليء بالبخار في هذا الوقت.</li>
</ol>5. فحص الجودة للشبكات
<ol><li>قم بقص الشبكات وتحميلها على أداة cryo-EM.</li>
	<li>استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز cryo-EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة. ملاحظة: في كثير من الأحيان ، تكون الشبكات جافة جدا ، أو تكون طبقة الجليد سميكة جدا. معدل نجاح الشبكات المعدة في درجات حرارة عالية أقل بكثير من ذلك في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية. يتم عرض النتائج التمثيلية للشبكات الجيدة والشبكات غير المرضية في القسم التالي.</li>
	<li>إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة (مثل وقت الانتظار ، وقت النشاف ، إلخ). إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة.</li>
</ol>6. جمع البيانات
<ol><li>انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة cryo-EM عالية الدقة.</li>
	<li>إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها. ملاحظة: كما هو موضح في منشورنا السابق ، لا تتأثر دقة الهيكل بدرجة الحرارة المرتفعة12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

في الخطوة 1 من البروتوكول ، تأكد من تثبيت أنبوب جهاز الطرد المركزي بشكل جيد ولا يسقط عندما تكون التجربة قيد التقدم. نظرا لتراكم عدد كبير من قطرات الماء في الغرفة ، مما قد يغير قدرة الامتزاز لورق الترشيح ، يوصى بعدم تجاوز الوقت الإجمالي للتجربة 30 دقيقة بعد وصول غرفة جهاز التزجيج إلى درجة حرارة التوازن. إذا تجاوز وقت التشغيل 30 دقيقة، يحتاج المشغل إلى استبدال ورق الترشيح والانتظار حتى توازن المقصورة بين درجة الحرارة والرطوبة مرة أخرى. في الخطوة 8 من البروتوكول ، يكون حجم العينة المقترح من 7-9 ميكرولتر أكبر من المعتاد لأنه...

استمرت تقنية cryo-EM لحل هياكل مجمعات البروتين في التحسن ، خاصة في اتجاه الحصول على هياكل عالية الدقة 1,2. في غضون ذلك ، تم توسيع نطاق تطبيقه أيضا عن طريق تغيير ظروف العينة مثل الرقم الهيدروجيني أو الليكاندات قبل عملية التزجيج3 ، والتي تنطوي على إعداد شبكات العينات تليها تجميد الغطس 4,5. شرط آخر مهم هو درجة الحرارة. على الرغم من أن تجارب cryo-EM ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، يتم إجراؤها في درجات حرارة منخفضة ، إلا أن البنية التي تم حلها بواسطة cryo-EM تعكس البنية في حالة الحل قبل التزجيج. حتى وقت قريب، تستخدم غالبية دراسات تحليل الجسيمات المفردة (SPA) cryo-EM عينات يتم الاحتفاظ بها على الجليد (أي عند 4 درجات مئوية) قبل التزجيج6، على الرغم من أن عددا من الدراسات تستخدم عينات عند درجة حرارة الغرفة حوالي7،8،9،10 أو تصل إلى 42 درجة مئوية 11. في تقرير حديث ، أجرينا دراسات تعتمد على درجة الحرارة لإنزيم اختزال حمض الكيتول (KARI) من الأركايون المحب للحرارة Sulfolobus solfataricus (Sso) في ست درجات حرارة مختلفة من 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية12. تشير دراساتنا إلى أنه من المهم إعداد شبكات العينات في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا وأن cryo-EM هي الطريقة الهيكلية الوحيدة الممكنة عمليا لحل بنية نفس مركب البروتين في درجات حرارة متعددة.
تتمثل الصعوبة الرئيسية للتزجيج في درجات الحرارة العالية في تقليل تكثيف البخار وتحقيق جليد رقيق. هنا نبلغ عن البروتوكول التفصيلي المستخدم لإعداد شبكات العينات في درجات حرارة عالية في دراستنا السابقة ل Sso-KARI 12. نفترض أن القراء أو المشاهدين لديهم خبرة بالفعل في إجراءات إعداد العينات ومعالجة البيانات الشاملة لتجارب cryo-EM ونؤكد على الجوانب ذات الصلة بارتفاع درجة الحرارة.

<table><tbody><tr><td>أنبوب الصقر</td><td>فالكون</td><td>352070</td><td>الحجم: 50 مل</td></tr><tr><td>ورق ترشيح</td><td>تيد بيلا</td><td>47000-100</td> <td>& أوسلاش ؛ 55/20 مم ، الصف 595</td></tr><tr><td>HI1210</td> حمام <td>مائي</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>K100X</td><td>علوم المجهر</td><td></td> الإلكتروني <td>توهج تفريغ</td></tr><tr><td>Quantifoil ، 1.2 / 1.3 200Mesh Cu grid</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>التصوير بجرعة منخفضة</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط فيتروبوت</td><td>تيد بيلا</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل cryo-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

عادة ما يتم إعداد شبكات العينات لتجارب المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عند درجة حرارة مثالية لتخزين العينات البيولوجية ، معظمها عند 4 درجات مئوية وأحيانا في درجة حرارة الغرفة. في الآونة الأخيرة ، اكتشفنا أن بنية البروتين التي تم حلها في درجة حرارة منخفضة قد لا تكون ذات صلة وظيفية ، خاصة بالنسبة للبروتينات من العتائق المحبة للحرارة. تم تطوير إجراء لإعداد عينات البروتين في درجات حرارة أعلى (تصل إلى 70 درجة مئوية) لتحليل cryo-EM. أظهرنا أن الهياكل من العينات المعدة في درجات حرارة أعلى ذات صلة وظيفية وتعتمد على درجة الحرارة. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجة حرارة عالية ، باستخدام 55 درجة مئوية كمثال. استخدمت التجربة جهاز تزجيج تم تعديله باستخدام أنبوب طرد مركزي إضافي ، وتم تحضين العينات عند 55 درجة مئوية. تم ضبط الإجراءات التفصيلية بدقة لتقليل تكثيف البخار والحصول على طبقة رقيقة من الجليد على الشبكة. يتم تقديم أمثلة على التجارب الناجحة وغير الناجحة.

يتم عرض نظرة عامة على التكبير المنخفض في الشكل 5A و B. اللوحة A هي مثال على شبكة ناجحة. هناك تدرج جليدي من أعلى اليسار (أكثر سمكا) إلى أسفل اليمين (أرق أو فارغ). تسهل هذه الشبكة العثور على سمك مناسب لطبقة الجليد في المنطقة الوسطى مناسب لجمع البيانات ، مثل المربعات الزرقاء والخضراء. الشبكة B جافة جدا. تحتوي المربعات الموجودة في الشبكة على تباين ساطع ، مما يعني أن الطبقة الجليدية رقيقة جدا أو لا توجد طبقة جليدية على الإطلاق. فقط المربعان المشار إليهما بالأسهم الحمراء مناسبان ل...

توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

تعتمد وظائف البروتينات على درجة الحرارة وهي مثالية عند درجة الحرارة. يوفر هذا البروتوكول طريقة لحل هياكل البروتين في درجات حرارة أعلى. يمكن أن يوفر هذا النهج هياكل ذات صلة وظيفيا ويعزز فهم الاعتماد على درجة حرارة هياكل البروتين.وسيوضح الإجراء يوان تشيه تشانغ ، مدير منشأة أكاديمية سينيكا كريو EM. ابدأ بعمل ثقب سنتيمتر واحد في أنبوب طرد مركزي 50 ملم في نهايته المغلقة. ضع الأنبوب في غرفة جهاز التزجيج عند مخرج المياه بالموجات فوق الصوتية.قم بإعداد درجة حرارة جهاز التزجيج إلى درجة الحرارة المحددة ، واسمح لغرفة جهاز التزجيج بالوصول إلى 55 درجة مئوية ورطوبة نسبية 100٪. دعها تقف لمدة نصف ساعة على الأقل لتحقيق الاستقرار في الظروف قبل بدء التجربة. ضع الحمام المائي على صفيحة ساخنة واضبط الصفيحة الساخنة على درجة الحرارة المطلوبة.تحقق من ذلك باستخدام ميزان حرارة للتأكد من أن الماء يصل إلى 55 درجة مئوية. احتضن العينة في الحمام المائي ، وقم بتسخين طرف الماصة على حافة الصفيحة الساخنة لمدة دقيقتين أو أكثر قبل تجربة النشاف. تفريغ التوهج شبكة مدعومة بالكربون في هولي عند 25 مللي أمبير لمدة 30 ثانية.ضع ورقة ترشيح التزجيج في غرفة جهاز التزجيج في موعد لا يتجاوز خمس دقائق قبل تجربة النشاف. احتضان الملقط مع الشبكة في جهاز التزجيج لمدة دقيقتين أو أكثر. قم ببناء حاوية الإيثان مع الإيثان وفقا للإجراءات القياسية ، مما يضمن عدم فيضان الإيثان.استخدم ماصة لتطبيق سبعة إلى تسعة ميكرولترات من العينة على الشبكة. ثم انتظر لمدة ثانية إلى ثانيتين ، ولطخت لمدة ثانية إلى ثانية ونصف ، وسرعان ما تغرق العينة في الإيثان السائل. انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى صندوق التبريد المخزن في النيتروجين السائل.قم بقص الشبكات وتفريغها للحصول على المجهر الإلكتروني أو أداة Cryo EM. استخدم شاشة العرض الخاصة بجهاز Cryo EM ووظيفة الجرعة المنخفضة للبرنامج ، لفحص حالة الجليد على الشبكة وتوزيع العينة على الشبكة. إذا لم تكن جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر عملية إعداد الشبكة بظروف متنوعة مثل وقت الانتظار ووقت النشاف وما إلى ذلك.إذا كانت جودة الشبكة الناتجة جيدة ، فكرر نفس الخطوات لإنشاء شبكات عند درجة حرارة مختلفة. انقل الشبكات ذات النوعية الجيدة إلى أداة Cryo EM عالية الدقة. إجراء جمع البيانات وتحليلها وفقا للإجراءات المعمول بها.في حالة الشبكة الناجحة ، يتكون تدرج الجليد من جليد أكثر سمكا في أعلى يسار الشبكة وجليد أرق في أسفل اليمين. ولوحظت مربعات زرقاء وخضراء مناسبة لجمع البيانات في الشبكة الناجحة. لوحظ تباين مشرق في الشبكة الأخرى.تشير إلى طبقة رقيقة من الجليد أو غياب الجليد. تم العثور على مربعين فقط مناسبين لجمع البيانات في الشبكة الثانية. تألفت إحدى الشبكات من الجليد في الغالب في شكل بلورات ، والتي كانت غير مناسبة لجمع البيانات.من ناحية أخرى ، أظهرت الشبكة الأخرى أن الطبقة الجليدية كانت في الغالب في حالة غير متبلورة مناسبة لجمع البيانات. يجب أن يكتمل إعداد الحاوية وغيرها وفقا لنقطة زمنية. التحكم في الوقت وإنهاء التجربة بسرعة ودقة هي الأكثر أهمية.اعتمادا على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول ، قد يتعين على الباحث أن يكون أكثر حذرا في إعداد الشروط البسيطة.

preparation-of-high-temperature-sample-grids-for-cryo-em

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نقدم بروتوكول بشأن كيفية الاستفادة من الإنتاجية العالية التصوير المقطعي البرد الإلكترون لتحديد دقة عالية في هياكل الموقع من الآلات الجزيئية. يسمح البروتوكول كميات كبيرة من البيانات التي سيتم تجهيزها، ويتجنب الاختناقات المشتركة، ويقلل من وقت التوقف عن العمل الموارد، مما يتيح للمستخدم التركيز على المسائل البيولوجية الهامة.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام جهاز صنع الشبكة السريعة لكل من صنع الشبكة السريعة والاختلاط السريع والتجميد لإجراء تجارب حل الوقت.

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

نسبة الإشارة إلى الضوضاء من البيانات هي واحدة من أهم الاعتبارات في إجراء قياسات الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يوفر خط الحزم VMXm بيئة منخفضة الضوضاء والميكروبات لمثل هذه التجارب. هنا، ونحن نصف أساليب إعداد عينة لتركيب وتبريد البلورات الدقيقة لVMXm وغيرها من الخطوط شعاعية البلورات الجزيئية الدقيقة.

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

توفر هذه الطريقة بروتوكولا مرنا يسهل الوصول إليه لإعداد شبكات المجهر الإلكتروني (EM) للتصوير بالتبريد الخلوي في الموقع والمجهر الضوئي والإلكتروني المرتبط (CLEM).

تحضير العينة للتصوير بالتبريد في الموقع لخلايا الثدييات

يتم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتصنيع شبكات تقارب الستربتافيدين لاستخدامها في الدراسات الهيكلية لعينات الجزيئات الكبيرة الصعبة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد.

تصنيع شبكة التقارب العقدي لإعداد عينة المجهر الإلكتروني بالتبريد

يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعا للباحثين لتوضيح الهياكل الجزيئية بكفاءة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).

تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

تعلم إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية لدراسة هياكل البروتينات بتقنية cryo-EM. يُظهر هذا البروتوكول كيفية تجميد العينات عند 70 درجة مئوية لفهم تأثيرات الحرارة على الوظائف البيولوجية.

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

استكشف المزيد من الفيديوهات