التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر

في هذا الفيديو، ونحن نصف التسمية الحرة بروتوكول التصوير الحي لالتقاط صور للفطريات نموذج aspergillus nidulans، وذلك باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المنقولة. نحن نستخدم هذه الصور لتحليل وقياس حركة نمو النيدولانات أسبيريلوس في كل من الوسائط السائلة والصلبة. يسمح التمثيل المرئي لهذا البروتوكول للمستخدمين بالتعرف على الخطوات الهامة لالتقاط الصور ومعالجة الصور المجهرية.

وهناك طريقة شائعة تستخدم لقياس النمو الفطري الخيطي هو اثنين من الجراثيم الفطرية تلقيح في طبق بيتري التي تحتوي على أجار المغذيات وقياس قطر المستعمرة النامية بعد بضعة أيام. ومع ذلك، فإن هذا النهج ليس حساسا بما يكفي لتحديد فروق النمو الدقيقة. لذلك، تم تطوير قياسات خلية واحدة باستخدام المجهر الفاصل الزمني.

هذه القياسات قادرة ليس فقط على تقديم نتائج دقيقة وكمية، ولكن أيضا لتعكس ديناميات النمو من الخلايا المختلفة داخل السكان. وعلاوة على ذلك، يهدف هذا النهج إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية المشاركة في استجابات النمو الفطرية للإشارات الذاتية والبيئية. تبدأ بصب 15 ملليلتر من أغار المغذيات السائلة في أطباق بيتري.

ضع الغطاء على القمة واتركه يبرد. استخدام الأشعة فوق البنفسجية لتعقيم لوحات. قبل streaking من سلالة الفطرية من الفائدة من الأسهم، تسخين حلقة الإيماءات في الموقد بونسن حتى يكون أحمر ساخن، تبريد الحلقة عن طريق طعنه في أجار.

دوامة الأنبوب وشرائط حلقة عبر سطح المتوسطة أجار الحد الأدنى تكملها مع الاحتياجات الغذائية المناسبة. احتضان لوحات لمدة يومين إلى ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. باستخدام مسواك معقمة، نقل عدد قليل من كونيديا عن طريق لمس بلطف مستعمرة واحدة إلى لوحات من وسائل الإعلام الكاملة.

احتضان لوحات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 37 درجة مئوية. يتم حصاد كونيديا من نيدولانس أسبيريلوس، في أنبوب دوامة معقم 1.5 ملليلتر، مع 1.0 ملليلتر من المياه المقطرة الأوتوكلاف التي تحتوي على 0.05٪ حجم لكل حجم، توين 80، للحد من عدد كتل كونيديا. يتم استخدام نسخة معدلة من طريقة أجار مقلوب لتصوير الفطريات الخيطية على سطح متوسط أجار.

بقعة في البداية 10 aliquots ميكرولتر من تعليق دوامة بقوة، ما يقرب من مرتين 104 خلايا لكل ملليلتر على أطباق بيتري من 15 ملليلتر الحد الأدنى المتوسط مع وزن واحد لكل حجم أجار. احتضان الثقافة التجريبية وفقا لمرحلة النمو التي سيتم التحقيق فيها. هنا نحتضن لمدة ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية.

بعد ذلك، شريحة من كتلة من أجار تحتوي على مستعمرة، وذلك باستخدام مشرط معقمة. هنا قطعنا إسفين من أجار على هامش المستعمرة، عكس ووضع شريحة أجار في ثمانية، شريحة جيدا. نقل 10 ميكرولتر aliquots من تعليق دوامة بقوة مرتبة من حوالي مرتين 10 في السلطة من أربعة في آبار شريحة بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من الحد الأدنى المتوسط مع المكملات الغذائية المناسبة.

احتضان الوقت ودرجة الحرارة ليتم فحصها في كل مرة. اختيار المجهر يعتمد على المعدات المتاحة. على أي حال، يجب أن يتضمن إعداد المجهر مرحلة مقلوبة أو غرفة بيئية أو على الأقل غرفة مع تحكم دقيق في درجة حرارة الهواء.

سخني في البداية الحرارة وغرفة المجهر لتثبيت درجة الحرارة المطلوبة. هنا وضعنا درجة الحرارة في 30 درجة مئوية. قم بتشغيل المجهر وطاقة الماسح الضوئي وطاقة الليزر والكمبيوتر، ثم قم بتحميل برنامج التصوير.

ضع الشريحة المعدة مسبقا بشكل جيد في مرحلة المجهر والتركيز. ابحث عن مجالات رؤية تحتوي على خلايا معزولة، وليس متداخلة، أو على الأقل غير مكتظة، لتسهيل قياسات النمو أثناء تحليل الصورة. حدد تقنية المجهر الضوئي المرسلة لاستخدامها وتنشيط كاشف الضوء المرسل وكذلك أجهزة الكشف عن الفلورسينس عند الضرورة.

تعيين المجهر للحصول على الصور في الفواصل الزمنية المطلوبة وبدء اكتساب سلسلة زمنية. ويتم تحميل وتصور ومعالجة الصور مع البرمجيات مفتوحة المصدر imageJ فيجي. تبدأ باستيراد الصور إلى فيجي باستخدام الإضافات بتنسيق.

حدد وضع اللون الافتراضي ومقياس تلقائي. من أجل تصور الطابع الزمني وشريط مقياس كما تراكب تذهب إلى تحليل والأدوات وشريط المقياس. تعيين المعلمات المطلوبة المتعلقة بعرض شريط المقياس وارتفاعه ولونه وموقعه.

انتقل إلى الصورة، خصائص، لعرض خصائص الصورة في برنامج imageJ فيجي. مراقبة معلومات الفاصل الزمني للإطار. هنا نستخدم فاصل زمني من حوالي 15 دقيقة واضغط على ما يرام.

ثم انتقل إلى الصورة، والمداخن، والتسمية، وتعيين المعلومات الصحيحة للفاصل الزمني. تعيين موقع التسمية عن طريق تعديل X و Y.Set وحدة القياس في نص الحقل ثم اضغط المعاينة. استخدام مطابقة الرسم البياني لتصحيح الإضاءة بين إطارات مختلفة عن طريق اختيار الصورة، وضبط، وتصحيح التبييض، مطابقة الرسم البياني.

تظهر نافذة جديدة مع إضاءة مصححة. استخدام البرنامج المساعد MtrackJ في الإضافات، MtrackJ، لتتبع تزايد تلميح واصلة لإضافة المسار، حدد زر إضافة في شريط الأدوات ووضع النقطة الأولى في طرف الواصلة باستخدام النقرة اليسرى من الماوس. سيتم نقل السلسلة الزمنية تلقائيا إلى الإطار التالي.

لإكمال عملية التتبع، انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس على النقطة الأخيرة، أو اضغط على مفتاح الهروب. التمرير جدول الإخراج، العمود الأكثر أهمية لحساب نمو تلميح الواصلة، هو السرعة في أي إطار معين. قياسات المسار الآمن، إضافة ملف، حفظ كما، إلى تنسيق الملف من اختيارك، على سبيل المثال، CSV، استيراد الملف المحفوظة في برنامج جدول البيانات وحساب التصور واختبارات أخرى.

اضغط على زر الفيلم لتوليد فيلم، RGB نوع اللون، التي تحتوي على إطارات مع المسارات رسمها في نفوسهم، والتي يمكن تصورها في أي مشغل الوسائط المتعددة القياسية. بعد هذا البروتوكول، التقطنا وحللنا صورا مختلفة تتوافق مع مراحل النمو والتطوير المختلفة للفطريات الخيطية aspergillus nidulans. ويبين الشكل مقارنة النوع البري وقياسات معدل نمو دلتا نهر الدلتا azhAD Delta.

دلتا azhAD دلتا ngnA هو سلالة مزدوجة المحذوفة في اثنين من الجينات المتورطة في إزالة السموم واستيعاب المنتج مقاتلة سامة L كما أضيفت في اثنين من حمض الكاروبوكسيليك. وهو يبين قياسات معدل نمو أقل دلالة إحصائيا مقارنة بسلالة النوع البري في الثقافات السائلة المغمورة بالمياه. هذا الاختلاف في النمو غير قابل للكشف عن طريق قياس منطقة مستعمرة من هاتين السلالات في المتوسط الحد الأدنى الصلبة.

خلية واحدة، والتصوير الحي على المدى الطويل هو ذات قيمة كبيرة في الجهود المبذولة للحصول على معلومات سباسي وزمنية من ديناميات البروتينات الخلوية. هذا البروتوكول مناسب أيضا لإجراء تصوير الخلايا الحية على المدى الطويل. هنا نرى إنبات كونيديا المشاركة في التعبير عن GFP المسمى البروتين eisosomal الأساسية بيلا و MRFP histonen H1. هنا في نقدم بروتوكولا لتحليل الحركية نمو الفطرية بطريقة استنساخها وموثوق بها دون الحاجة إلى أي تجربة تحليل الصور السابقة من المستخدم.

يسمح هذا البروتوكول بالتحديد الكمي الدقيق الموضوعي للنمو الفطري.