Name: تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: تعلم بروتوكول معالجة البلغم لتحليل التدفق الخلوي عالي الإنتاجية في تشخيص أمراض الرئة مثل الربو وسرطان الرئة وكوفيد-19. يوفر طريقة موثوقة لتحليل الخلايا بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونود أن نشكر ديفيد رودريغيز على مساعدته في إعداد الرقم. تم تشغيل عينات البلغم على BD LSR II في مرفق الموارد المشتركة لقياس الخلايا في UT Health San Antonio Flow ، بدعم من UT Health و NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) وUL1 TR001120 (منحة CTSA).

يتم تنفيذ جميع خطوات معالجة البلغم في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
1. إعداد الكاشف قبل البدء في تفكك البلغم
<ol><li>إذابة 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 25 مل لكل عينة على الجليد، والحفاظ على البرد حتى الاستخدام. تنبيه: PFA سام عن طريق الاستنشاق والاتصال بالبشرة. إعداد المثبت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتجميد في -20 درجة مئوية في 25 مل aliquots حتى الاستخدام.</li>
	<li>تقريب وزن العينة وذوبان ما يكفي من 0.1٪ Dithiothreitol (DTT) للخطوة 2.2 وبذلك إلى 37 درجة مئوية. (يجب تخزين الاقتباسات من DTT عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.)</li>
	<li>جلب ما يكفي 0.5٪ N-أسيتيل- L-السيستين (NAC) تصل إلى 37 درجة مئوية للخطوة 2.2. (يجب أن يتم إجراء NAC جديدة أسبوعيا وتخزينها في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.)</li>
</ol>2. فصافر البلغم
<ol><li>وزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفكك. ملاحظة: تعتبر العينة صغيرة إذا كان الوزن الأولي ≤3 غرام، ومتوسطة إذا كانت >3 غرام ولكن ≤8 غرام، وكبيرة إذا كانت >8 ولكن ≤16 غرام، وكبيرة جدا إذا كانت العينة تزن >16 غرام. سيتم استخدام المؤشرات الصغيرة والمتوسطة والكبيرة والكبيرة للغاية في جميع أنحاء البروتوكول. تختلف كمية الكواشف المطلوبة للتفكك ووضع العلامات وفقا لحجم عينة البلغم.</li>
	<li>نقل عينة صغيرة إلى أنبوب نظيف مخروطي 50 مل، عينة متوسطة إلى زجاجة نظيفة 250 مل البلاستيك المتاح، أو عينة كبيرة وكبيرة جدا إلى زجاجة نظيفة 500 مل البلاستيك المتاح. أضف وزن عينة 1 مل/غرام من 0.5٪ NAC و4 مل/غرام وزن عينة 0.1٪ DTT.</li>
	<li>دوامة بأقصى سرعة (لمدة 15 s)، ثم الصخور في درجة حرارة الغرفة (بأقصى سرعة) لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>تمييع العينة بأربعة مجلدات من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) (استنادا إلى الحجم الإجمالي للعينة + الكواشف) لتحييد NAC و DTT؛ دوامة بسرعة بأقصى سرعة والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في أقصى سرعة.</li>
	<li>تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر من النايلون شبكة الخلية مصفاة (ق) في واحد أو أكثر من 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي (ق) لإنشاء تعليق خلية واحدة.</li>
	<li>طرد الخلايا في 800 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. يستنشق supernatant، والجمع بين جميع الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 مل، ومن ثم غسل الكريات مع HBSS باستخدام نفس الشروط.</li>
	<li>Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم. ملاحظة: يتم إعادة إنفاق عينة صغيرة في 250 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينة متوسطة في 760 ميكرولتر من HBSS. يتم إعادة إنفاق عينات كبيرة وكبيرة جدا في 1460 ميكرولتر من HBSS.</li>
	<li>اتخاذ aliquot تعليق الخلية لعدد الخلايا الحية / الميتة باستخدام تريبان الأزرق. ملاحظة: لعينة صغيرة، استخدم 5 ميكرولتر. لعينة متوسطة أو كبيرة أو كبيرة جدا، استخدم 10 ميكرولتر. تمييع 1:10 مع HBSS.<ol>
<li>مزيج 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق لتحقيق تخفيف عينة النهائي من 1:40. تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعد الخلايا. ملاحظة: قد يكون من الضروري ضبط التخفيف النهائي إذا كانت أرقام الخلايا منخفضة جدا أو عالية جدا لتحقيق عدد دقيق. ينصح بشدة هنا باستشارات Guiot et al.20 للتمييز بشكل صحيح بين خلايا البلغم والحطام. وهذا أمر ضروري لعدد الخلايا دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>من عينة كبيرة جدا، وإزالة 50 × 106 خلايا من المجموع وإضافة إلى أنبوب جديد مع ما يكفي من HBSS المضافة لخلق حجم إجمالي قدره 1700 ميكرولتر. ملاحظة: خذ بعين الاعتبار هذا نموذج كبير لبقية البروتوكول. يمكن التخلص من العينات المتبقية أو استخدامها لأغراض أخرى.</li>
</ol>3. الأجسام المضادة وصبغة حيوية تلطيخ
<ol><li>اختيار الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ ملاحظة: يعرض الجدول 1 الأجسام المضادة وصبغة البقاء المستخدمة في هذا البروتوكول وخلايا الخلايا التي تحددها.<ol>
<li>تسمية الأنابيب التي تحتوي على خلايا البلغم (انظر الجدول 2 للتسميات).</li>
		<li>استخدام أنابيب قياس الخلايا تدفق 5 مل (متوافقة مع تدفق السيتومتر المستخدمة) للأنبوب عينة مع الخلايا غير الملطخة وأنبوب مع التحكم isotype. استخدام أنابيب مخروطية 15 مل لعينات الدم والأنابيب الظهارية. ملاحظة: سيتم نقل هذه العينات لتدفق أنابيب قياس الخلايا بعد تلطيخ الأجسام المضادة والتثبيت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تسمية أنابيب التعويض (الجدول 3). ملاحظة: استخدم أنابيب قياس الخلايا التدفق 5 مل متوافقة مع تدفق الخلايا المستخدمة.</li>
	<li>إضافة كمية HBSS والأجسام المضادة و / أو صبغ إلى كل من أنابيب الخلية البلغم وأنابيب التعويض على النحو المبين في الجدول 2 والجدول 3، على التوالي. ملاحظة: أضف العازلة (HBBS) والأجسام المضادة، وصبغ لجميع الأنابيب قبل إضافة خلايا أو حبات التعويض لضمان أن جميع أنابيب 'تلطيخ الوقت متسقة.</li>
	<li>إضافة كميات حجم الخلية البلغم المسرودة في الجدول 2 إلى أنابيب المقايسة.</li>
	<li>إضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في الجدول 3.</li>
	<li>احتضان جميع الأنابيب (أنابيب الفحص والتعويض) على الجليد، محمية من الضوء، لمدة 35 دقيقة. ثم، ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 800 × ز.</li>
	<li>لأنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف.</li>
	<li>أضف 0.5 مل من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض، وخزنها على الجليد عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي.</li>
	<li>يستنشق الناطق الفائق من الأنابيب غير الملطخة ، والدم ، والأنابيب الظهارية بعد الطرد المركزي (الخطوة 3.6 من قسم تلطيخ الأجسام المضادة) وتخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب.</li>
</ol>4. التثبيت مع 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)
<ol><li>إضافة الباردة 1٪ PFA (التي ينبغي إذابة الآن) إلى غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية. 2 مل إلى أنابيب غير ملطخة وisotype، و 10 مل إلى الدم والأنابيب الظهارية.</li>
	<li>احتضان الأنابيب على الجليد، محمية من الضوء لمدة ساعة واحدة. دوامة بسرعة بأقصى سرعة بعد 30 دقيقة.</li>
	<li>ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. ثم أنابيب الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 1600 س غ.</li>
	<li>يستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار أنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype.</li>
	<li>حساب حجم HBSS لإعادة إنفاق الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا. ملاحظة: حجم إعادة الإنفاق = 0.15 x [إجمالي عدد الخلايا (الخطوة 8 من فصخ البلغم) / 106]. استخدم 50 × 106 كعدد الخلايا لعينة كبيرة جدا.</li>
	<li>تخزين جميع أنابيب العينة والتعويض، محمية من الضوء على الجليد في 4 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. ملاحظة: لم يتم اختبار هذا البروتوكول للتخزين لأكثر من 24 ساعة.</li>
</ol>5. الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي
<ol><li>تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم. ملاحظة: يفترض هذا القسم من البروتوكول أن الشخص الذي يشغل مقياس التدفق الخلوي مدرب على استخدام الأداة المتاحة له، ولا سيما فيما يتعلق بالإجراءات اليومية بما في ذلك التحقق من استقرار البصريات وأنظمة السوائل، وتقنيات توحيد تشتت الضوء وكثافة الفلورسينس، فضلا عن حساب وتطبيق مصفوفة التعويض الصحيحة.</li>
	<li>استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) الخرز لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد قطعة الأرض بأكملها دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور. ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لضمان إزالة الحطام الذي تقل كميةه عن 5 ميكرومترات عن طريق تحليل ما بعد الاقتناء. اعتمادا على مقياس التدفق الخلوي المستخدم، يجب أن تضع في اعتبارك أن أصغر الخرز لا يتم استبعادها مع العتبة (عند استخدام LSR II أو Lyric) أو مع التمييز العالي (باستخدام مقياس تدفق Navios EX). لS NAVIOS EX، تم استخدام مكسب من 2 للتشتت إلى الأمام والجانب، والجهد من 236 للتشتت إلى الأمام، و 250 للتشتت الجانب. بالنسبة إلى LSR II ، تم استخدام جهد مبعثر أمامي من 165 وجهد جانبي مبعثر من 190.</li>
	<li>تعيين معدل التدفق إلى متوسط (LSR II) أو مرتفع (Navios EX). ملاحظة: يمكن استخدام معدل التدفق المتوسط أو المرتفع لمعظم الأدوات للحصول على أنابيب البلغم. من المهم ملاحظة أن استخدام بطيء جدا لمعدل التدفق أو تخفيف العينة قد يؤدي إلى استقرار الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة الدوامة التي ليست مرغوبة. ولذلك، فإن الالتزام بحجم إعادة الإنفاق المحسوب في الخطوة 4.6 يجب أن يؤدي إلى كثافة خلوية يمكن الحصول عليها بسرعة ولكن ليس تسد الجهاز.</li>
	<li>ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على مقياس. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating وارشادات حول كيفية ضبط الفولتية وفقا لذلك. ملاحظة: تأكد من تحديد كافة المعلمات المطلوبة في إطار تحديد المعلمة قبل اكتساب أو أن البيانات لن يتم الحصول عليها.</li>
	<li>الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة isotype الملطخة، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية. ملاحظة: إذا كان تعليق الخلية مركزا جدا بحيث لا يسمح لقياس التدفق الخلوي بتشغيل العينات دون انسداد، فقد يتم تخفيف العينات بشكل أكبر باستخدام HBSS.</li>
</ol>

جميع المؤلفين هم من الموظفين السابقين أو الحاليين من تقنيات bioAffinity.

يتضمن المحتوى الخلوي للسبيتوم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا واسعة النطاق ، غالبا ما يرافقها الكثير من الحطام37. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل البلغم مراقبة الجودة التي تؤكد أن العينة يتم جمعها من الرئة بدلا من تجويف الفم38. لذلك ، فإنه ليس من السهل تحليل البلغم عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو الحال بالنسبة للدم ، على سبيل المثال ، والذي يطلق تعليق خلايا أنظف ومتجانسة. وقد عالج هذا البروتوكول جميع هذه القضايا: توفير إعدادات الأجهزة باستخدام حبات حجم محددة لضمان إمكانية ...

وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت واحد1,2,3,4. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز المناعي2 والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي(5)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم المختلفة6,7,8. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم تطبيق قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل البلغم لأغراض التشخيص. ومع ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى أن تقييم مجموعات الخلايا المناعية في البلغم (أهم مجموعة فرعية من الخلايا) قد يكون عونا كبيرا في تشخيص و/أو مراقبة أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)12,13,14,15. وعلاوة على ذلك، فإن وجود علامات خاصة بالظهارية التي يمكن استخدامها في قياس التدفق الخلوي يسمح باستجواب المجموعة الفرعية التالية الأكثر أهمية من الخلايا في البلغم، خلايا ظهارية الرئة.
بالإضافة إلى القدرة على تحليل العديد من مجموعات الخلايا المتميزة من أصول أنسجة مختلفة ، يمكن لقياس التدفق أن يقيم أعدادا كبيرة من الخلايا في فترة قصيرة نسبيا. وبالمقارنة، فإن أنواع التحليلات المستندة إلى الشرائح والسيكلوتية كثيرا ما تتطلب موظفين و/أو معدات عالية التخصص. يمكن أن تكون هذه التحليلات كثيفة العمالة ، مما يؤدي إلى تحليل نسبة فقط من عينة البلغم16.
تحد ثلاث قضايا حرجة من الاستخدام الواسع النطاق للسبيتوم في قياس التدفق الخلوي. تتعلق المشكلة الأولى بمجموعة البلغم. يتم جمع البلغم من خلال سعال النفخ الذي يطرد المخاط من الرئتين إلى تجويف الفم ، ويبصق لاحقا في كوب جمع. منذ المخاط يسافر من خلال تجويف الفم، وهناك فرصة كبيرة للتلوث SEC. هذا التلوث يعقد تحليل العينة ، ولكن يتم تصحيح المشكلة بسهولة على منصة قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في هذه الدراسة.
ليس كل شخص يمكن أن تنتج البلغم تلقائيا; لذلك ، تم تطوير العديد من الأجهزة للمساعدة في جمع البلغم بطريقة غير الغازية17. البخاخات هو واحد من هذه الأجهزة، وقد ثبت لإنتاج عينات البلغم موثوق بها18,19,20. على الرغم من أن البخاخات هي وسيلة فعالة جدا لجمع البلغم غير الغازية ، إلا أن استخدامه لا يزال يتطلب إعدادا في منشأة طبية مع موظفين متخصصين21. في المقابل، يمكن استخدام الأجهزة المحمولة مثل الناي الرئة22,23,24 و acapella16,25 في المنزل لأنها سهلة الاستخدام للغاية. هذه الأجهزة مساعدة على حد سواء آمنة وفعالة من حيث التكلفة.
بالنسبة لنا، أعطى أكابيلا نتائج أفضل باستمرار من الناي الرئة16، وبالتالي، تم اختيار جهاز أكابيلا لمجموعات البلغم. تم تحديد عينة جمع لمدة 3 أيام لأن الغرض الأساسي لاستخدام البلغم هو تطوير اختبار الكشف عن سرطان الرئة16. وقد تبين أن عينة لمدة 3 أيام يزيد من احتمال الكشف عن سرطان الرئة مقارنة مع عينة 1-أو 2-يوم26,27,28. ومع ذلك، قد تكون أساليب أخرى لجمع البلغم الأفضل لأغراض مختلفة. إذا تم استخدام طريقة مختلفة لجمع البلغم من تلك الموصوفة هنا ، فمن المستحسن أن تثن بعناية كل الأجسام المضادة أو الصبغة المستخدمة لتحليل تدفق القياسات الخلوية ؛ تتوفر بيانات قليلة جدا حول كيفية تأثير طرق جمع البلغم المختلفة على البروتينات المستهدفة لقياس التدفق الخلوي.
القضية الثانية التي تقلل من الحماس لاستخدام البلغم للتشخيص ، تتعلق في المقام الأول بتدفق قياس الخلايا ، هو رقم الخلية. المشكلة هي جمع خلايا كافية قابلة للحياة لتحليل موثوق بها. أظهرت دراستان أن عينات البلغم التي تم جمعها بطرق غير جراحية ، بمساعدة جهاز مساعدة ، تحتوي على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة التي يمكن استخدامها في التشخيص السريري أو الدراسات البحثية16،24. ومع ذلك، لم تتناول أي من هاتين الدراستين مسألة أرقام الخلايا المتعلقة ب قياس التدفق الخلوي.
بالنسبة للدراسات التي تشكل الأساس لهذا البروتوكول، تم جمع عينات البلغم من المشاركين المعرضين لخطر كبير للإصابة بسرطان الرئة باتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة لكل موقع دراسة. تم تعريف المشاركين المعرضين لخطر كبير على أنه بين 55-75 سنة ، بعد أن دخنوا 30 عاما ولم يقلعوا عن التدخين خلال السنوات ال 15 الماضية. وقد تبين للمرضى كيفية استخدام جهاز أكابيلا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة29 وجمع البلغم لمدة ثلاثة أيام متتالية في المنزل. تم الاحتفاظ بالعينة في الثلاجة حتى المجموعة الأخيرة. وفي يوم الجمع الأخير، شحنت العينة إلى المختبر طوال الليل مع حزمة باردة مجمدة. وقد عولجت العينات لتصبح تعليقا لزنزانة واحدة في اليوم الذي وردت فيه. مع هذه الطريقة لجمع البلغم، يتم الحصول على أكثر من ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة لتحليل التدفق الخلوي موثوق بها.
وأخيرا، والمتعلقة المشكلة رقم الخلية السابقة، هو السؤال عن كيفية تحرير خلايا البلغم من بيئتها mucinous. كيف يمكن الحفاظ على الخلايا قابلة للحياة وخلق تعليق خلية واحدة لا تسد مقياس التدفق الخلوي؟ استنادا إلى العمل الأولي من قبل Pizzichini et al.30 و Miller et al.31 ، يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوقة لمعالجة البلغم في تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل التدفق الخلوي. وقد استخدمت هذه الطريقة مبادئ توجيهية راسخة في تدفق الخلايا32,33,34 لوضع استراتيجية فعالة لوضع العلامات على الأجسام المضادة لتحديد الخلايا الدموية والظهارية في البلغم وتوفير إعدادات الأداة، وتدابير مراقبة الجودة، والمبادئ التوجيهية للتحليل توحيد تحليل البلغم على منصة تدفق الخلايا.

<table><tbody><tr><td>1٪ بارافورمالدهايد فلو فيكس</td><td>بوليساينس</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 & مايكرو ؛ مصافي خلايا النايلون M ، فالكون # 352360</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 م هيدروكسيد الصوديوم</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب الصقر المخروطي</td><td>فيشر Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 مضاد للإنسان CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 مضاد للإنسان CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 السيتوكراتين المضاد للإنسان</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK و CD3 و CD19 Isotype</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC isotype</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus تعويض الخرز</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>كورنينج زجاجة معقمة قابلة للتخلص من البوليسترين 250 مل</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>09-761-4</td><td></td></tr><tr><td>زجاجة معقمة قابلة للتخلص من البوليسترين كورنينج 500 مل</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS& حبات T</td> BD <td>Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC المضادة للإنسان CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>قابلية للإصلاح بقعة</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>Beckman Coulter</td><td>A69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>فيشر العلمية</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NIST الخرز, 05 & mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST الخرز, 20 & mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST الخرز, 30 & mu; M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE مضاد للإنسان CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 مضاد للإنسان EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206 / EpCAM النمط المتماثل</td><td>BD Biosciences</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 المضاد للإنسان CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>سترات الصوديوم ثنائي هيدرات</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>محلول تريبان بلو ، 0.4٪</td> <td>فيشر 15250061</td><td></td> <td>العلمي</td></tr></tbody></table>

تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

يتم تحليل البلغم ، الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة المحتوى الخلوي والميزات الأخرى للبيئة الدقيقة لفهم صحة الرئة ، تقليديا باستخدام منهجيات قائمة على علم الخلايا. فائدته محدودة لأن قراءة الشرائح تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موظفين متخصصين للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الحطام الواسع النطاق ووجود عدد كبير جدا من الخلايا الظهارية الحرشفية ، أو خلايا الخد ، غالبا ما يجعل العينة غير كافية للتشخيص. وعلى النقيض من ذلك، يسمح قياس التدفق الخلوي بطباعة الخلايا ذات الإنتاجية العالية مع استبعاد الحطام ومركبات الكربون المستدامة في نفس الوقت.
يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة فعالة لتفكيك البلغم إلى تعليق خلية واحدة ، وصمة عار الأجسام المضادة وإصلاح المجموعات الخلوية ، والحصول على عينات على منصة قياس التدفق الخلوي. استراتيجية gating التي تصف استبعاد الحطام والخلايا الميتة (بما في ذلك الشركات الصغيرة والمتوسطة) ومزدوجات الخلية معروضة هنا. علاوة على ذلك ، يشرح هذا العمل أيضا كيفية تحليل خلايا البلغم الواحدة القابلة للتطبيق استنادا إلى مجموعة من التمايز (CD)45 مجموعات سكانية إيجابية وسلبية لتوصيف مجموعات فرعية من النسب الدموي والظهاري. كما يتم توفير مقياس لمراقبة الجودة من خلال تحديد الضامة الخاصة بالرئة كدليل على أن العينة مشتقة من الرئة وليست لعابا. وأخيرا، فقد ثبت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على منصات مختلفة من خلال توفير ملامح البلغم من نفس المريض تحليلها على ثلاثة مقاييس تدفق الخلايا. نافيوس EX، LSR الثاني، ولريك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل علامات خلوية إضافية ذات أهمية. يتم تقديم طريقة لتحليل عينة البلغم بأكملها على منصة قياس التدفق الخلوي هنا التي تجعل البلغم قابلا لتطوير تشخيص عالي الإنتاجية لمرض الرئة.

تم تطوير هذا البروتوكول مع وضع مختبر سريري في الاعتبار. وكان التركيز أثناء وضع البروتوكول على البساطة والكفاءة والقابلية للاستنساخ. ووجد أن الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت في معالجة البلغم كانت عد الخلايا. لذلك، يتم إعداد البروتوكول بطريقة يمكن بها معالجة البلغم ووضع العلامات على الخلايا بشكل مستقل عن عد الخلايا دون فقدان الوقت. ويمكن بعد ذلك الحصول على عدد دقيق للخلايا، وهو أمر لا يزال ضروريا لتمييع العينة بشكل مناسب لتشغيل دون عائق، خلال فترة حضانة وضع العلامات على الأجسام المضادة.
يستخدم هذا ا...

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعدم ربط البلغم بتعليق خلية واحدة والتوصيف اللاحق للمجموعات الفرعية الخلوية على منصات قياس التدفق الخلوي القياسية.

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

يحل هذا البروتوكول التحديات الشائعة التي واجهت معالجة البلغم التي جعلت من الصعب في الماضي استخدامها مع قياس التدفق الخلوي لأغراض التشخيص السريري عالية الإنتاجية. تم تصميم هذا البروتوكول لتوفير الوقت باستخدام وزن البلغم لتحديد الأجسام المضادة وصبغ تلطيخ وحدات التخزين. أثناء حضانة تلطيخ، يمكن إجراء عدد الخلايا لخطوات المصب.من المهم تحقيق عدد دقيق للخلايا لتحديد حجم إعادة التعليق الصحيح لمنع أي مشاكل عند التشغيل على مقياس التدفق الخلوي. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في مجالات البحث التي تحقق في صحة الرئة. على سبيل المثال، يمكن دراسة أمراض مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن أو الربو أو سرطان الرئة أو آثار COVID.إثبات الإجراء سيكون الدكتور مايكل لاي، عالم البحث والتطوير من مختبري. في البداية، قم بوزن عينة البلغم لتحديد أحجام الكواشف التفككية. نقل العينة إلى وعاء الحجم المناسب على أساس وزن البلغم، ثم إضافة ملليلتر واحد لكل غرام من 0.5٪ NAC وأربعة ملليلتر لكل غرام من 0.1٪ DTT.دوامة العينات بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية والصخور في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمييع هذه العينة مع 4X هانكس متوازن محلول الملح أو HBSS لتحييد NAC وDTT. وبعد دوامة سريعة، صخرة العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.تصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرومتر مصفاة شبكة النايلون الخلية في واحد أو أكثر من 50 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي المخروطية لإنشاء تعليق خلية واحدة. بيليه أسفل الخلايا. بعد قرصنة الفائقة، والجمع بين الكريات في أنبوب واحد مخروطي 15 ملليلتر ويغسل مع HBSS في ظل نفس الظروف.Resuspend بيليه الخلية في حجم العازلة التي يحددها الوزن الأولي للعينة البلغم. تأخذ aliquot من تعليق الخلية وخلط 10 ميكرولتر من تخفيف البلغم مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان الأزرق، ثم تحميل في غرف العد من مقياس الدم لعدد الخلايا الحية / الميتة. تسمية البلغم في أنابيب التعويض.إضافة الأجسام المضادة HBSS وصبغ إلى كل أنبوب الخلية البلغم وأنابيب التعويض كما هو مبين في النص. إضافة خلايا البلغم إلى أنابيب المقايسة وإضافة حبات التعويض إلى أنابيب التعويض كما هو مذكور في النص. احتضان جميع الأنابيب على الجليد محمية من الضوء لمدة 35 دقيقة.ثم بعد ملء الأنابيب مع HBSS الباردة الجليد، والطرد المركزي في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في 800 مرة G.For أنابيب التعويض، يستنشق supernatant أقرب إلى الكريات ممكن ونفض الغبار الكريات لتخفيف. بعد ذلك، أضف 0.5 ملليلتر من HBSS الباردة إلى أنابيب التعويض وتخزين الأنابيب على الجليد في منطقة محمية للضوء حتى الحاجة لتحليل قياس التدفق الخلوي. ثم يستنشق supernatant من البلغم غير ملطخة، isotype، الدم، والأنابيب الظهارية.تخفيف الكريات عن طريق النقر على الأنابيب. أضف ملليلترين من 1٪ PFA إلى أنابيب غير ملونة و isotype و 10 ملليلترات إلى الدم والأنابيب الظهارية. احتضان الأنابيب على الجليد بطريقة محمية خفيفة لمدة 30 دقيقة، ثم دوامة بسرعة بأقصى سرعة واحتضان مرة أخرى لمدة 30 دقيقة أخرى.ثم ملء الأنابيب مع HBSS الجليد الباردة. بعد ذلك ، طرد الأنابيب في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق في 1 ، 600 مرة G.Aspirate أكبر قدر ممكن من الناسخ دون إزعاج بيليه الخلية ونفض الغبار عن الأنبوب مع الأصابع لتخفيف الخلايا ، ثم إضافة 200 ميكرولتر من HBSS الباردة إلى أنابيب غير ملطخة وisotype. حساب وإضافة الحجم المطلوب من HBSS لإعادة ضغط الدم وأنبوب الظهارية وفقا لإجمالي عدد الخلايا.تخزين جميع العينات في أنابيب التعويض المحمية من الضوء على الجليد في أربع درجات مئوية حتى يتم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. تطبيق إجراءات بدء التشغيل المناسبة لقياس التدفق الخلوي المستخدم. استخدام مزيج من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا أو الخرز NIST لضمان أن يتم تعيين مبعثر إلى الأمام والجهدية مبعثر الجانب لوضع الخرز NIST لتمتد المؤامرة دون وضع الخرز قريبة جدا من المحاور.تعيين معدل التدفق إلى متوسط ل LSRII أو مرتفع ل Navios EX. ضبط الفولتية لكل معلمة تستخدم لمعلمات مبعثر والفلورسنت لوضع السكان الخلية على نطاق واسع. استخدام الأرقام مع استراتيجية gating كدليل لضبط الفولتية وفقا لذلك. الحصول على بيانات لعينة البلغم غير الملطخة أولا، تليها عينة ملطخة isotype، ومن ثم أنبوب الدم وأنبوب الظهارية.تم استخدام وزن البلغم لتحديد الأجسام المضادة أو صبغ كميات للتلطيخ. لم يكن الارتباط بين وزن البلغم وقوة الخلية قويا. تم تقسيم عينات البلغم إلى أربع فئات الوزن، والتي تتجمع في توزيع غلة الخلية.تم اختيار كل الأجسام المضادة المستخدمة في تركيز على مرحلة الهضبة مع أعلى مؤشر تلطيخ كما تركيز العمل. في جميع فئات الوزن، كان متوسط تلوث لجنة الأوراق المالية والبورصة أقل من 20٪ مع النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة. يتم تقديم استراتيجية النذييل المستخدمة للتحليل.واستخدمت الخرز NIST لتعيين البوابة التي تم تطبيقها على عينة البلغم للقضاء على الحطام. تم إزالة الحطام الصغير من خلال بوابة العرض. تم استخدام صبغة الجدوى للقضاء على الخلايا الميتة ، في حين أن بوابة singlet أزالت doublets.سمح وضع العلامات المضادة للCD45 بفصل خلايا البلغم الفردية الحية إلى خلية دم ومقصورة خلايا غير دموية. تمت مقارنة الملفات الشخصية التي تم الحصول عليها من Navios EX و LSRII و Lyric. وتظهر استراتيجية اللغات للقضاء على الحطام والخلايا الميتة والمزدوجات ومقارنة ملامح الدم وغير الدم.سمحت لنا هذه التقنية بتطبيق هذه الطرق للكشف عن خطر الإصابة بسرطان الرئة لاستخدامه كاختبار سريري غير غازي.

quality-controlled-sputum-analysis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يوضح هذا الفيديو استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب الخلايا المناعية المختلفة في سائل غسل القصبات الهوائية. في البداية ، يتم تحديد الخلايا المناعية المفردة باستخدام صبغة قابلة للحياة ، متبوعة بالتلوين التفاضلي لبروتينات العلامات السطحية ، مما يتيح التعداد الدقيق لكل نوع من أنواع الخلايا.

تحديد وتعداد الخلايا المناعية في سائل الغسيل القصبي السنخي عن طريق قياس التدفق الخلوي

يعد استخدام أخذ عينات الفرشاة الخلوية لجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة من باطن عنق الرحم تقنية طفيفة التوغل توفر عينات لتحليل مناعة الجهاز التناسلي الأنثوي. في هذا البروتوكول ، نصف جمع عينات الفرشاة الخلوية وعزل الخلايا المناعية لمقايسات قياس التدفق الخلوي.

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

توضح هذه الطريقة تقنية لتقييم وظيفة الخلايا المحببة عن طريق قياس البلعمة للبكتيريا والانفجار التأكسدي في نفس الوقت. سمح قياس التدفق الخلوي المستند إلى الصورة بتحديد ثلاث مجموعات فرعية متميزة من الخلايا المحببة المنشطة والتي اختلفت جميعها في قدرتها الوظيفية النسبية.

الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة في المختبر

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد جزيئات محملة حساسية التدفق الخلوي. المحيطة جزيئات الجسيمات يمكن أن يكون بمثابة ناقلات من المواد المسببة للحساسية كثف. نعرض هنا أن التدفق الخلوي، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف المواد الصلبة العالقة&gt; 0.5 ميكرون في القطر، ويمكن استخدامها لقياس هذه الجزيئات المحملة حساسية.

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

وينعكس الوضع الصحي للرئة عن طريق نوع وعدد الخلايا المناعية الموجودة في القصبات الرئوية. نحن تصف تقنية غسل القصبات التي تسمح العزلة ودراسة الخلايا غير متماثلة والعوامل القابلة للذوبان من الجهاز التنفسي السفلي من الفئران.

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

توضح هذه المقالة الطيفية الخلوي، نهجا جديدا في التدفق الخلوي يستخدم الأشكال من أطياف الانبعاث للتمييز fluorochromes. خوارزمية استبدال التعويضات ويمكن علاج لصناعة السيارات في مضان كمعلمة مستقلة. يسمح هذا النهج الجديد لتحليل سليم للخلايا معزولة من الأعضاء الصلبة.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

هنا يمكننا وصف أسلوب الاستقراء البصاق. ويشرح هذا البروتوكول أيضا البصاق التجهيز لأداء عدد خلايا المتمايزة وجمع البصاق طافية وخلايا لمزيد من التحليل.

منهجية الاستقراء البصاق وتجهيز المختبرات

يمكن أن يساهم عزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتوصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي بشكل كبير في فهم نمط الاستجابة المناعية ضد الغرسات. يصف هذا البحث طريقة دقيقة لعزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتلطيخها لتحليل التدفق الخلوي.

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

توفر البروتوكولات الموصوفة هنا دليلا لتصور وقياس نشاط البروتياز العدلي في البلغم البشري. تمتد تطبيقات هذا التحليل من تقييم العلاجات المضادة للالتهابات ، إلى التحقق من صحة العلامات الحيوية ، وفحص الأدوية والدراسات السريرية الفوج الكبيرة.

رصد نيوتروفيلي إيلاستاز وكاثيبسين G النشاط في عينات البلغم البشري

خلال السنوات الأخيرة، وقد استخدمت المقايسات القائم على الخلية الحية بنجاح للكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضدات السطحية ومتعلق بتكوين جزئي. هنا، نحن تصف طريقة استخدام تدفق عالية الإنتاجية الخلوي تمكن من تحليل الأفواج الكبيرة من المرضى. وكشف عن الأجسام المضادة رواية تحسين تشخيص وعلاج اضطرابات مناعية.

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

تعلم بروتوكول معالجة البلغم لتحليل التدفق الخلوي عالي الإنتاجية في تشخيص أمراض الرئة مثل الربو وسرطان الرئة وكوفيد-19. يوفر طريقة موثوقة لتحليل الخلايا بدقة.

تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات