الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC)

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في حل المشكلات المتعلقة بطرق زراعة الميكروبات التقليدية. وهو يوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وموثوقة النتائج للزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. تعمل هذه التقنية على أتمتة العمليات وتقليل استهلاك العمالة بشكل أكبر.

وفي الوقت نفسه ، لديها أداء ثقافي جيد مع نتائج موثوقة وعمليات بسيطة. وتستخدم هذه التقنية بشكل رئيسي في مجالات أبحاث علم الأحياء الدقيقة، مثل قياس منحنى النمو، والتطور المختبري التكيفي، وتحليل عامل واحد متعدد المستويات. ابدأ الاستعدادات للتجربة عن طريق توصيل إبرة المحقنة بقطر داخلي يبلغ 0.41 ملم وقطر خارجي يبلغ 0.71 ملم بموصل سريع A وزجاجة كاشف.

ثم تعقيم جميع المعدات عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتثبيت رقاقة الموائع الدقيقة ، افتح باب غرفة التشغيل وارفع مسبار الألياف البصرية. بعد محاذاة ثقوب المجال الكهربائي مع الإبر ، ضع الشريحة برفق على قاعدة التمثال ، ثم أدخل عمودي تحديد المواقع في فتحات تحديد المواقع ووضع مسبار الألياف البصرية.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الموصل السريع A الموجود على الشريحة بالمنفذ المقابل لنظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية أو MMC وفقا لرقم الموضع كما هو موضح في المخطوطة. عند الانتهاء ، أغلق باب غرفة العمليات. قم بتخفيف تعليق الإشريكية القولونية MG1655 المزروع بمتوسط OD600 من 0.05 إلى 0.1 للحصول على 10 ملليلتر من محلول البكتيريا الأولي.

لتهيئة MMC ، انقر فوق علامة التبويب تهيئة. عندما تظهر واجهة التهيئة ، اضبط درجة حرارة الزراعة على 37 درجة مئوية وقيمة الإشارة الكهروضوئية على 0.6. ستستغرق التهيئة حوالي 20 دقيقة.

في وقت لاحق ، ضع زجاجة كاشف معقمة على المقعد النظيف وشد الغطاء. استخدم حقنة معقمة سعة 10 ملليلترات لحقن ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من زيت MMC من إبرة المحقنة إلى الأنبوب الجانبي في زجاجة الكاشف. ثم قم بإمالة وتدوير زجاجة الكاشف ببطء لجعل الزيت يتسلل بالكامل إلى الجدار الداخلي.

بعد حقن خمسة ملليلترات من محلول البكتيريا الأولي في الزجاجة ، املأ زجاجة الكاشف عن طريق حقن خمسة إلى سبعة ملليلترات من زيت MMC. اسحب الموصل السريع المستقل A من زجاجة الكاشف وأدخل الموصل السريع A في الموصل السريع B للزجاجة لإكمال عملية حقن العينة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، افتح باب غرفة العمليات لوضع زجاجة الكاشف في الحمام المعدني.

اسحب موصل C2 الخاص بالشريحة والموصل السريع A لزجاجة الكاشف. قم بتوصيل موصل الأنبوب الجانبي لزجاجة الكاشف بموصل C2 وموصل الأنبوب العلوي بموصل O2. ثم أغلق باب غرفة العمليات.

لاختيار وظيفة قياس منحنى النمو ، انقر فوق منحنى النمو في واجهة إعداد المعلمة أدخل الرقم ك 15. ثم قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD واضبط الطول الموجي على 600 نانومتر. انقر فوق علامة التبويب ابدأ لبدء توليد القطيرات.

ستستغرق العملية 15 دقيقة حتى تكتمل. عندما تظهر نافذة منبثقة على الواجهة الرئيسية تطالب برسالة ، افتح باب غرفة التشغيل لإخراج زجاجة الكاشف وتوصيل موصلات C2 و O2. بعد إغلاق الباب ، انقر فوق الزر موافق ( OK) في النافذة المنبثقة لزراعة القطرات تلقائيا واكتشاف قيم OD.

عندما يصل منحنى النمو إلى المرحلة الثابتة، انقر فوق الزر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. حدد مسار حفظ البيانات وقم بتصدير قيمة OD المسجلة خلال فترة الزراعة بتنسيق CVS لرسم منحنى النمو، استخدم برنامج تعيين مثل Excel وOrigin 9.0. حقن الكميات المطلوبة من محلول البكتيريا الأولي ، الوسط الطازج ، وزيت MMC في زجاجات الكاشف المعقمة المنفصلة لمحلول البكتيريا الأولي في الوسط الطازج كما هو موضح سابقا.

لاختيار وظيفة التطور التكيفي ، انقر فوق ALE في البرنامج. في واجهة إعداد المعلمات، قم بتشغيل مفتاح اكتشاف OD، ثم قم بتعيين جميع المعلمات الموضحة في المخطوطة واضغط على علامة التبويب ابدأ لبدء توليد القطيرات. ستستغرق العملية حوالي 25 دقيقة.

خلال كل فترة زراعة فرعية ، لاحظ ما إذا كانت قيم OD القصوى للقطرات قد زادت بشكل كبير. إذا حدثت الزيادة وتلبي متطلبات التجربة ، فانقر فوق زر تصدير البيانات لتصدير بيانات OD. لاستخراج القطرات المستهدفة من MMC ، انقر فوق علامة التبويب الفحص لتحديد وظيفة استخراج القطيرات.

ثم اختر خيار التجميع وانقر على أرقام القطرات المستهدفة. عند الانتهاء ، انقر فوق موافق. انتظر النافذة المنبثقة التي تطالب بظهور رسالة. ثم ضع الموصل السريع CF في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للجمع وانقر فوق موافق. بعد دقيقة إلى دقيقتين عندما تنبثق واجهة البرنامج نافذة جديدة تطالب برسالة ، أدخل الموصل السريع CF مرة أخرى وانقر فوق موافق لجعل MMC يستمر في التشغيل.

عندما تصل القطرة المستهدفة التالية إلى موقع التعرف على القطيرات ، قم بجمعها كما هو محدد من قبل. استخدم ماصة سعة 2.5 ميكرولتر لإخراج القطيرة ووضعها على صفيحة صلبة بحجم 90 ملم ، تليها نشر القطرة بالتساوي باستخدام قضيب زجاجي مطلي بمثلث بطول جانبي يبلغ ثلاثة سنتيمترات ، ثم قم بزراعة القطرة في حاضنة درجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. في وقت لاحق ، اختر ثلاث إلى خمس مستعمرات مستقلة من البكتيريا لزراعة كل مستعمرة على حدة في قارورة مخفوق سعة 50 ملليلتر مع 10 ملليلتر من الوسط الطازج في حاضنة تهتز بمعدل 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة.

بعد الحضانة ، اتبع اللوائح القياسية ذات الصلة لتخزين محلول البكتيريا المستزرعة في أنبوب الجلسرين. يظهر التحليل التمثيلي منحنيات نمو 50 قطرة في عملية التطور التكيفي بأكملها. لوحظ أن سلالة الإشريكية القولونية الأساسية للميثانول أو MeSV2.2 أظهرت نموا بطيئا أوليا يليه نمو سريع.

تم رسم منحنى نمو القطيرة السادسة في عملية التطور التكيفية بأكملها بشكل منفصل. كان الحد الأقصى لقيمة OD600 في الجيل الأول 0.37 ، والذي ارتفع إلى 0.58 في فترة الزراعة الفرعية الأخيرة ، مما يشير إلى أن السلالة في القطرة الستة قد حققت تطورا تكيفيا واضحا. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة منحنيات نمو سلالة القطرة الستة والسلالة الأولية.

أظهرت سلالة القطيرات الستة معدل نمو محدد أقصى وتركيز خلية أعلى في المرحلة الثابتة من السلالة الأولية. الشيء الأكثر أهمية هو التأكد من أن اتصال شريحة الأداة وزجاجة الكاشف صحيح ، وهو قطرات للعمليات للمضي قدما بشكل طبيعي. توفر هذه الطريقة للباحثين فكرة جديدة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة وتوفر أيضا منصة فعالة ومنخفضة التكلفة للتطور التكيفي للسلالات.