تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic
أغسطس 19, 2021
Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.
هذا البروتوكول مهم لأنه طريقة ذاتية المنشأ، أو نشطة بالضوء، لتحفيز التعبير الجيني، في كائن حي سليم. في حالتنا، جنين حمار وحشي. ميزة هذه التقنية، هو أنه يستخدم الضوء، كعامل تحريض، والذي يسمح للسيطرة دقيقة جدا، سباسيال والزمنية من التعريفي.
وسيكون هذا البروتوكول مفيدا لأي حالة يكون فيها التعبير الجيني غير القابل للانفعاط مفيدا. وهذا يشمل أشياء مثل تتبع النسب، والحصول على وظيفة المقايسات أو تجارب الإنقاذ. لتبدأ مع موقف لوحة LED بالنسبة لأطباق بيتري التي تحتوي على الأجنة لتقديم 1.5 مللي واط لكل سنتيمتر مربع قوة الضوء إلى عدة أجنة في وقت واحد.
لتقليل خطر تلف الصورة إلى منشط النسخ الخلفي، نشر الضوء على فترات ساعة واحدة على الخروج باستخدام تتابع مؤقت، إذا مضيئة لأكثر من ثلاث ساعات. إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم وصندوق مقاوم للضوء للتحكم في الظلام.
إزالة الأجنة من الإضاءة، بعد مدة التنشيط المطلوبة. لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي، استخدم عدة استخراج الحمض النووي الريبي. نقل الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الدقيقة وإزالة الماء الزائد البيض.
بعد إضافة عازلة تحلل، تجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية. نقل lysate إلى عدة العمود المقدمة واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية الجيش الملكي النيبالي. تخزين الحمض النووي الريبي المنقى، في ناقص 20 إلى ناقص 80 درجة مئوية، حتى استخدام أو توليفها على الفور cDNA من ميكروغرام واحد، مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام عدة توليف cDNA، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
إضافة ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي في جدار رقيقة 0.2 ملليلتر، أنبوب PCR، التي تحتوي على أربعة ميكرولترات، من خمسة أضعاف مزيج التفاعل الرئيسي cDNA، تليها إضافة ميكرولتر واحد، من 20 مرة عكس محلول إنزيم النسخ. المقبل تشكل حجم النهائي من 20 ميكرولتر، مع المياه الخالية من النيوكليز. وضع الأنبوب في دورة الحرارية المبرمجة لتوليف cDNA.
تخزين cDNA توليفها في ناقص 20 درجة مئوية حتى استخدام أو استخدامها على الفور للتقييم الكمي. إعداد ردود الفعل PCR الكمية التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر السيبرانية. خمسة أضعاف الأقراص المدمجة المخففة وGFP التمهيدية في تركيز نانومولار 325 في ثلاثية الجسيمات وإجراء رد الفعل في جهاز PCR المبرمجة في الوقت الحقيقي.
عند الانتهاء من رد الفعل، وتحليل منحنى ذوبان لتحديد خصوصية رد الفعل. حساب التعريفي الضوء تنشيط كما أضعاف التغيير بالنسبة للأجنة التحكم باستخدام طريقة مزدوجة دلتا CT. واستخدام البرامج الإحصائية لتحديد أهمية.
بعد إزالة الأجنة من الإضاءة، شل الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ Tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي. احصل على صور مضانة و brightfield على مجهر ستيريو فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.
وأشار القياس الكمي لتعبير GFP إلى تحريض التعبير في أقرب وقت بعد 30 دقيقة من التعرض للضوء الأزرق. ثم استمرت مستويات التعبير عن GFP في الزيادة حتى ست ساعات ، بعد التنشيط باطراد. كما تم تقييم تحريض GFP نوعيا من خلال فحص كثافة الفلورسينس في نفس الوقت نقاط ما بعد التنشيط.
لوحظت لأول مرة مضان GFP فوق مستويات الخلفية في ثلاث ساعات بعد التنشيط وأصبحت أكثر إشراقا بشكل ملحوظ في ست ساعات بعد التنشيط. في المقابل السيطرة على الأجنة لجميع النقاط الزمنية، وأبقى في الظلام، لم تظهر، أي مضان GFP ملحوظ. يجب أن يكون ضوء التنشيط في النطاق الأزرق من طيف الضوء المرئي.
يحتوي كل من ضوء الغرفة وأشعة الشمس على بعض الضوء الأزرق. لذا احرص على حماية عناصر التحكم السلبية من أي مصادر للضوء المحيط. نظام TAEL C120، مشفر وراثيا ووحدات ويمكن أن تدفع التعبير عن أي جين من الفائدة.
لذلك، جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، يمكن استخدامه للإجابة على مجموعة من الأسئلة البيولوجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول استخدام علم البصريات الوراثي (optogenetics) لتحقيق تعبير جيني محفز بالضوء في أجنة أسماك الزيبرا. يتيح نظام TAEL/C120 المستجيب للضوء الأزرق تحكماً دقيقاً في التعبير الجيني داخل كائن حي سليم.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم البصريات الوراثي
- التعبير الجيني
- نماذج سمك الزيبرا
خلفية علمية
- علم البصريات الوراثي (Optogenetics) هو طريقة مفعلة بالضوء لتحفيز التعبير الجيني.
- توفر هذه التقنية تحكماً مكانياً وزمانياً في عملية التحفيز.
- وهي مفيدة بشكل خاص في تتبع السلالات الخلوية ومقايسات اكتساب الوظيفة.
- تُستخدم أجنة أسماك الزيبرفيش كنموذج لدراسة التعبير الجيني في الجسم الحي (in vivo).
الغرض من الدراسة
- توضيح طريقة للتعبير الجيني المستحث بالضوء.
- توفير بروتوكول للباحثين المهتمين بتطبيقات علم البصريات الوراثي (optogenetics).
- تسهيل التجارب التي تتطلب تحكماً دقيقاً في التعبير الجيني.
الطرق المستخدمة
- تحديد موضع لوحة LED بالنسبة لأطباق بتري التي تحتوي على الأجنة.
- توصيل ضوء بكثافة 1.5 milliwatts per square centimeter.
- تحفيز التعبير الجيني في عدة أجنة في وقت واحد.
- استخدام نظام TAEL/C120 البصري الوراثي للتحكم في الجينات.
النتائج الرئيسية
- التحريض الناجح للتعبير الجيني في أجنة سمك الزيبرفيش.
- إثبات التحكم المكاني والزماني في تنشيط الجينات.
- توفير بروتوكول موثوق للدراسات البصرية الوراثية (optogenetic) المستقبلية.
- تسليط الضوء على مزايا استخدام الضوء كعامل تحريض.
الاستنتاجات
- توفر علم البصريات الوراثي (Optogenetics) أداة قوية لدراسة وظيفة الجينات.
- يعتبر نظام TAEL/C120 فعالاً لتحفيز التعبير الجيني داخل الجسم الحي (in vivo).
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في سيناريوهات بحثية بيولوجية متنوعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التحكم البصري الوراثي (Optogenetic control) في التعبير الجيني استقصاءً دقيقاً للأهداف البيولوجية في الجسم الحي من حيث الزمان والمكان، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ويوفر نظام TAEL/C120 منصة مشفرة وراثياً وقابلة للتبديل بواسطة الضوء للتحقق من الفرضيات العلاجية من خلال قراءات كمية. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال السماح بتعديل عكسي ومعتمد على الجرعة للتعبير الجيني في أجنة أسماك الزيبرا.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تنشيط جيني قابل للاستحثاث والعكس في نموذج فقاري سليم.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف عن طريق ربط التعبير الناتج عن الضوء بالقراءات المظهرية عبر مراسل GFP والتقدير الكمي بـ qRT-PCR.
- القيمة التنبؤية: تسهل تجارب اكتساب الوظيفة وتجارب الإنقاذ لتقييم كفاية الهدف وأهمية المسار في السياقات ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج تعبيراً كمياً لبروتين GFP يعتمد على الضوء، ويمكن قياسه بواسطة المجهر الفلوري وqRT-PCR لفحص المركبات أو الظروف التجريبية.
- القابلية للتكرار: تتيح بروتوكولات تحفيز موحدة بكثافة ضوئية محددة (1.5 mW/cm²) وتحكم زمني لتقليل التباين بين المكررات.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع تنسيقات الآبار المتعددة باستخدام لوحات LED لمعالجة أجنة متعددة في آن واحد تحت إضاءة محكومة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- نمذجة الأمراض: يدعم النماذج قبل السريرية القائمة على سمك الزيبر في الحالات التي تحاكي فيها السيطرة الزمنية على التعبير الجيني التدخلات العلاجية القابلة للاستحثاث.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: تعمل مخرجات GFP وqRT-PCR كقراءات ديناميكية دوائية قابلة للنقل لتقييم تفعيل المسار وتعديل الهدف.
- تخفيف المخاطر: يسمح بتقليل مخاطر الأهداف من خلال اختبار الضرورة والكفاية عبر تصميمات استعادة الوظيفة وزيادة الوظيفة القابلة للاستحثاث قبل إجراء الدراسات على الثدييات.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح التحقق المتكرر من الأهداف الجزيئية في نظام فقاري.
- بيولوجيا الاكتشاف: تختبر كفاية الهدف وتنشيط المسار من خلال التعبير المحفز بالضوء والموقوت في الجسم الحي (in vivo).
- المسح: يوفر مخرجات كمية ومعيرة (التغير المضاعف في GFP) لمقارنة الظروف الجينية أو الدوائية.
- التحليلات: تستخدم طريقة double delta CT qRT-PCR وكثافة الفلورة للمقارنة الإحصائية بين المجموعات المحفزة ومجموعات الضبط المظلمة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط التعبير القابل للاستحثاث بالنتائج المظهرية في سمك الزيبرا، مما يدعم الاستمرارية في اختبارات الفعالية قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمكن لنظام TAEL/C120 النمطي قيادة أي جين مستهدف، مما يتيح إعادة استخدامه عبر أهداف ومشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال توفير تحكم زمني دقيق في التعبير الجيني في كائن حي معقد.
- القيمة التشغيلية: يضمن قابلية التكرار من خلال تسليم الضوء بشكل معياري واستخدام ضوابط مظلمة داخلية لمراعاة التغيرات البيئية.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف عبر تمكين التعديل السريع والعكسي للهدف لتقييم العواقب المظهرية.
- التأثير على المحفظة: يدعم ترتيب الأولويات المعدل حسب المخاطر من خلال التحقق من صحة الأهداف في نظام تحريضي ذي صلة فسيولوجياً قبل الانتقال إلى مراحل التطوير كثيفة الموارد.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تربية أسماك الزيبروفيش، والحقن المجهري، وإعداد أجهزة علم البصريات الوراثي.
- يعتمد على أنظمة إضاءة LED قادرة على توفير شدة ضوء أزرق دقيقة وتحكم في التوقيت.
- يستلزم وجود بروتوكولات موحدة لمدة التعرض للضوء والحفاظ على ضوابط الظلام لضمان إمكانية مقارنة البيانات.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التوسيع ليشمل مراحل جنينية مختلفة أو خلفيات وراثية متنوعة.
- يتقيد بمدى اختراق الضوء في الأنسجة المعتمة، رغم أن هذا الأمر يتم تخفيفه في أجنة الزيبروفيش بسبب الوضوح البصري.
