Name: تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: تعلم طريقة التحكم في التعبير الجيني بالضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 البصري الوراثي. يوفر هذا البروتوكول تحكمًا مكانيًا وزمنيًا دقيقًا للتفعيل الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.

أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا ميرسيد.
1. عبور حمار وحشي وجمع الأجنة
<ol><li>الحفاظ على خطوط حمار وحشي معدلة وراثيا منفصلة تحتوي إما على المنشط النسخ TAEL أو الجين مراسل C120 التي تسيطر عليها للحد من التنشيط زائفة.</li>
	<li>عبر 6-8 حمار وحشي الكبار من كل خط باستخدام أساليب قياسية9 لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة التي تحتوي على كل من TAEL و C120 المكونات (الشكل 1B). ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن كلا المكونين بشكل عابر من خلال الميكروينيكشن الحمض النووي مرنا أو البلازميد باستخدام الأساليب القياسية10.</li>
	<li>جمع الأجنة في أطباق بيتري التي تحتوي على ماء البيض (60 ميكروغرام / مل ملح البحر الفوري المحيط المذاب في الماء المقطر)، مع ما يقرب من 30 جنينا لكل حالة ليتم اختبارها.</li>
	<li>ضع الأطباق في صندوق مقاوم للضوء أو غطيها بورق الألومنيوم لتقليل التنشيط غير المقصود بواسطة الضوء المحيط (انظر الجدول 1).</li>
</ol>2. تحريض الضوء العالمي
<ol><li>استخدم لوحة LED ذات الضوء الأزرق (465 نانومتر) لتوصيل الضوء الأزرق المنشط إلى عدة أجنة في وقت واحد.</li>
	<li>ضع لوحة LED نسبة إلى أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة بحيث تكون القوة الفعلية للضوء التي تتلقاها الأجنة حوالي 1.5 كيلوواط /سم2 كما تقاس بالطاقة الخفيفة ومقياس الطاقة(الشكل 2A).</li>
	<li>نبض الضوء على فترات من 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة باستخدام تتابع مؤقت إذا مضيئة لأكثر من 3 ساعة للحد من خطر photodamage إلى المنشط النسخ TAEL5،8. ملاحظة: قد تحتاج المدة الدقيقة للإضاءة إلى تحسينها لتطبيقات معينة. في هذا البروتوكول، يتم توفير أمثلة لمدة الإضاءة من 30 دقيقة، 1 ساعة، 3 ساعة، و 6 ساعة.</li>
	<li>إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف.</li>
	<li>ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم في صندوق مقاوم للضوء أو تغطيها بورق الألومنيوم للتحكم في الظلام.</li>
</ol>3. التقييم الكمي للتحريض بواسطة qRT-PCR
<ol><li>إزالة الأجنة من الإضاءة بعد مدة التنشيط المطلوبة.</li>
	<li>استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 30-50 ضوء تنشيط و 30-50 الأجنة الداكنة باستخدام عدة العزل الجيش الملكي النيبالي بعد تعليمات عدة.<ol>
<li>نقل الأجنة إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق وإزالة ماء البيض الزائد. إضافة تحلل العازلة وتجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية.</li>
		<li>نقل lysate إلى عمود مجموعة المقدمة ومتابعة مع تعليمات المجموعة. انتقل فورا إلى الخطوة 3.3 أو تخزين الحمض النووي الريبي المنقى عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام 1 ميكروغرام مجموع الحمض النووي الريبي لتركيب cDNA باستخدام مجموعة توليف cDNA بعد تعليمات عدة.<ol>
<li>خذ أنبوب PCR ذو الجدران الرقيقة 0.2 مل ، وأضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي إلى 4 ميكرولتر من مزيج التفاعل الرئيسي 5x cDNA (يحتوي على المخزن المؤقت الأمثل ، وoligo-dT والمبرمجين العشوائيين ، وdNTPs) ، و1 ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 20x ، والمياه الخالية من النيوكلياز إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.</li>
		<li>ضع الأنبوب في دراجة حرارية مبرمجة على النحو التالي: 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم اضغط على 4 درجات مئوية. انتقل فورا إلى الخطوة 3.4 أو تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد ردود فعل qPCR التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر SYBR، 5 أضعاف CDNA المخفف (الخطوة 3.3)، و 325 nM من كل التمهيدي لGFP. ملاحظة: التمهيديات المستخدمة في هذا البروتوكول كما يلي. GFP إلى الأمام: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'؛ GFP عكس: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGGATGC-3'; ef1a إلى الأمام 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a عكس: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').</li>
	<li>نفذ ردود فعل qPCR في جهاز PCR في الوقت الحقيقي. ملاحظة: برنامج PCR: التنشيط الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يليه 40 دورة من 30 s عند 95 درجة مئوية، و 30 درجة مئوية عند 60 درجة مئوية، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية.</li>
	<li>إجراء تحليل منحنى ذوبان مرة واحدة يتم الانتهاء من PCR لتحديد خصوصية رد الفعل. إجراء ثلاث نسخ متماثلة تقنية لكل عينة.</li>
	<li>حساب التعريفي الضوء تنشيط كما تغيير أضعاف بالنسبة للأجنة أبقى في الظلام باستخدام 2-ΔΔCt طريقة11. يمكن تحديد الأهمية الإحصائية من خلال حزمة برامج الإحصاءات.</li>
</ol>4. التقييم النوعي للتحريض بواسطة المجهر الفلوري
<ol><li>إزالة الأجنة من الإضاءة بعد المدة المطلوبة من التنشيط.</li>
	<li>شل حركة الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي.</li>
	<li>احصل على صور مضانة و brightfield على منظار مجسم فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. استخدم إعدادات الحصول على صورة متطابقة لكافة العينات.</li>
	<li>دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض للضوء ، مما يشير إلى أن هذا النهج يمتلك حركية سريعة وسريعة الاستجابة نسبيا.
يمكن أن تؤثر عدة عوامل على مستويات الحث. الأكثر أهمية هي الطول الموجي وقوة تنشيط الضوء. في هذا البروتوكول، تم استخدام 465 ...

تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.
وعلى النقيض من هذه النهج التقليدية، فإن المنشطات البصرية البصرية المنشطة للضوء لديها القدرة على التحكم المكاني والزمني الدقيق في التعبير الجيني4. تم تطوير نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء وتحسينه للاستخدام في أجنة حمار وحشي5،6. ويستند هذا النظام على عامل النسخ ضوء تنشيط الذاتية من البكتيريا E. litoralis7,8. يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL يحتوي على مجال تحويل Kal-TA4 ، ومجال LOV الأزرق المستجيب للضوء (استشعار الجهد الخفيف الأكسجين) ، ومجال ربط الحمض النووي الحلزوني (HTH)5. عندما مضيئة، والمجالات LOV الخضوع لتغيير تشكيلي يسمح اثنين من جزيئات TAEL لتعتيم، وربط إلى المروج C120 تستجيب TAEL، والشروع في نسخ من جين المصب منالفائدة 5،8. يعرض نظام TAEL/C120 تحريضا سريعا وقويا بأقل قدر من السمية ، ويمكن تنشيطه من خلال العديد من طرائق التسليم الخفيف المختلفة. وفي الآونة الأخيرة، أدخلت تحسينات على نظام TAEL/C120 بإضافة إشارة توطين نووية إلى TAEL (TAEL-N) وباقتران العنصر التنظيمي C120 بجهة تسويق أساسية cFos (C120F)(الشكل 1A). هذه التعديلات تحسين مستويات التعريفي بأكثر من 15 أضعاف6.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام لوحة LED بسيطة لتنشيط نظام TAEL/C120 والحث على التعبير في كل مكان عن جين المراسل، GFP. يمكن رصد تحريض التعبير نوعيا من خلال مراقبة كثافة الفلورسينس أو كميا عن طريق قياس مستويات النسخ باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). هذا البروتوكول سوف تظهر نظام TAEL/C120 كأداة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام التي تمكن تنظيم قوي للتعبير الجيني في الجسم الحي.

<table><tbody><tr><td>BioRender أداة التوضيح العلمي المستندة إلى الويب</td><td>BioRender</td><td></td><td>https://biorender.com/</td></tr> <tr><td>كاميرا رقمية ملونة CCD</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>وحدة تحكم مقياس الطاقة والطاقة المدمجة ، مرشح الإثارة LCD الرقمي مقاس 4 بوصات</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>، 545 نانومتر</td><td>Olympus</td><td>ET545 / 25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini Kit</td><td>GE الرعاية الصحية</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>ملح البحر الفوري للمحيط</td><td></td> الفوري <td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>مارس أكوا عكس الضوء 165 واط ضوء حوض السمك LED (أزرق وأبيض)</td><td>أمازون</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>ميثيل السليلوز</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW مفتاح مؤقت رقمي قابل للبرمجة</td><td>أمازون</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR مزيج أخضر سريع</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr>برنامج <td></td><td></td><td></td><td>فوتوشوب لمعالجة الصور</td></tr><tr><td>Adobe Prism الرسوم البيانية والإحصاء</td><td>برنامج GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 نظام PCR في الوقت الحقيقي</td><td>الأنظمة الحيوية</td><td>التطبيقية A28137</td><td></td></tr><tr><td>المجهر المجسم</td><td>أوليمبوس</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 مصدر ضوء LED</td><td>مضان Excelitas</td><td>010-00326R</td><td>توقف. تم استبداله ب X-Cite mini +</td></tr></tbody></table>

تعبير gfp الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام tael/c120 optogenetic

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.

لهذه المظاهرة ، C120 استجابة GFP خط مراسل (TG (C120F : GFP)ucm107))عبرت مع خط المعدلة وراثيا التي تعبر عن TAEL - N في كل مكان من ubiquitin ب (ubb) المروج (Tg(ubb:TAEL -N)ucm113))لإنتاج الأجنة المعدلة وراثيا مزدوجة تحتوي على كلا العنصرين. 24 ساعة بعد الإخصاب، تعرضت الأجنة لتنشيط الضوء الأزرق، نبض على تردد 1 ساعة على / 1 ساعة قبالة. تم تحديد تعريف تعبير GFP كميا بواسطة qRT-PCR عند 30 دقيقة و1 ساعة و3 ح و6 ساعة بعد التنشيط(الشكل 2B <stro...

Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

هذا البروتوكول مهم لأنه طريقة ذاتية المنشأ، أو نشطة بالضوء، لتحفيز التعبير الجيني، في كائن حي سليم. في حالتنا، جنين حمار وحشي. ميزة هذه التقنية، هو أنه يستخدم الضوء، كعامل تحريض، والذي يسمح للسيطرة دقيقة جدا، سباسيال والزمنية من التعريفي.وسيكون هذا البروتوكول مفيدا لأي حالة يكون فيها التعبير الجيني غير القابل للانفعاط مفيدا. وهذا يشمل أشياء مثل تتبع النسب، والحصول على وظيفة المقايسات أو تجارب الإنقاذ. لتبدأ مع موقف لوحة LED بالنسبة لأطباق بيتري التي تحتوي على الأجنة لتقديم 1.5 مللي واط لكل سنتيمتر مربع قوة الضوء إلى عدة أجنة في وقت واحد.لتقليل خطر تلف الصورة إلى منشط النسخ الخلفي، نشر الضوء على فترات ساعة واحدة على الخروج باستخدام تتابع مؤقت، إذا مضيئة لأكثر من ثلاث ساعات. إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم وصندوق مقاوم للضوء للتحكم في الظلام.إزالة الأجنة من الإضاءة، بعد مدة التنشيط المطلوبة. لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي، استخدم عدة استخراج الحمض النووي الريبي. نقل الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الدقيقة وإزالة الماء الزائد البيض.بعد إضافة عازلة تحلل، تجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية. نقل lysate إلى عدة العمود المقدمة واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية الجيش الملكي النيبالي. تخزين الحمض النووي الريبي المنقى، في ناقص 20 إلى ناقص 80 درجة مئوية، حتى استخدام أو توليفها على الفور cDNA من ميكروغرام واحد، مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام عدة توليف cDNA، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.إضافة ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي في جدار رقيقة 0.2 ملليلتر، أنبوب PCR، التي تحتوي على أربعة ميكرولترات، من خمسة أضعاف مزيج التفاعل الرئيسي cDNA، تليها إضافة ميكرولتر واحد، من 20 مرة عكس محلول إنزيم النسخ. المقبل تشكل حجم النهائي من 20 ميكرولتر، مع المياه الخالية من النيوكليز. وضع الأنبوب في دورة الحرارية المبرمجة لتوليف cDNA.تخزين cDNA توليفها في ناقص 20 درجة مئوية حتى استخدام أو استخدامها على الفور للتقييم الكمي. إعداد ردود الفعل PCR الكمية التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر السيبرانية. خمسة أضعاف الأقراص المدمجة المخففة وGFP التمهيدية في تركيز نانومولار 325 في ثلاثية الجسيمات وإجراء رد الفعل في جهاز PCR المبرمجة في الوقت الحقيقي.عند الانتهاء من رد الفعل، وتحليل منحنى ذوبان لتحديد خصوصية رد الفعل. حساب التعريفي الضوء تنشيط كما أضعاف التغيير بالنسبة للأجنة التحكم باستخدام طريقة مزدوجة دلتا CT. واستخدام البرامج الإحصائية لتحديد أهمية.بعد إزالة الأجنة من الإضاءة، شل الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ Tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي. احصل على صور مضانة و brightfield على مجهر ستيريو فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.وأشار القياس الكمي لتعبير GFP إلى تحريض التعبير في أقرب وقت بعد 30 دقيقة من التعرض للضوء الأزرق. ثم استمرت مستويات التعبير عن GFP في الزيادة حتى ست ساعات ، بعد التنشيط باطراد. كما تم تقييم تحريض GFP نوعيا من خلال فحص كثافة الفلورسينس في نفس الوقت نقاط ما بعد التنشيط.لوحظت لأول مرة مضان GFP فوق مستويات الخلفية في ثلاث ساعات بعد التنشيط وأصبحت أكثر إشراقا بشكل ملحوظ في ست ساعات بعد التنشيط. في المقابل السيطرة على الأجنة لجميع النقاط الزمنية، وأبقى في الظلام، لم تظهر، أي مضان GFP ملحوظ. يجب أن يكون ضوء التنشيط في النطاق الأزرق من طيف الضوء المرئي.يحتوي كل من ضوء الغرفة وأشعة الشمس على بعض الضوء الأزرق. لذا احرص على حماية عناصر التحكم السلبية من أي مصادر للضوء المحيط. نظام TAEL C120، مشفر وراثيا ووحدات ويمكن أن تدفع التعبير عن أي جين من الفائدة.لذلك، جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، يمكن استخدامه للإجابة على مجموعة من الأسئلة البيولوجية.

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

Multiphoton المجهري يسمح السيطرة على الفوتونات منخفضة الطاقة الضوئية مع الاختراق العميق والضيائية مخفضة. نحن تصف استخدام هذه التكنولوجيا لوضع العلامات الخلية تعيش في الأجنة الزرد. يمكن أن يكون هذا البروتوكول تكييفها بسهولة للتحريض ، صورة من الجزيئات التي تستجيب للضوء مختلف.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

يصف هذا الفيديو تقنيات البصريات الوراثية عن طريق تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المعدلة وراثيا وتسجيل الاستجابة السلوكية المستحثة باستخدام كاميرا فيديو عالية السرعة.

علم البصريات الوراثي لسمك الزرد: تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابات السلوكية لليرقات

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء لتوليد خط معدل وراثيا مستقر لأسماك الزرد يعبر بشكل أساسي عن بروتين مؤشر جهد الفلورسنت بعد الحقن المشترك لنظام الينقولات Tol2 الذي يشتمل على الترانسبوزياز mRNA و Tol2 ينقولات ترميز مؤشر الجهد الفلوري.

Tol2 Transgenesis Zebrafish بوساطة الينقولات: إجراء لتوليد أسماك الزرد المعدلة وراثيا بعد الحقن المشترك لنظام Tol2 في أجنة أسماك الزرد المخصبة

جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو عالية السرعة.

Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

دراسة أقرب أحداث تطور الخلية سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية غير محورية لفهم وعلاج السرطان. نحن هنا تصف طريقة للحث مشروط التحولات الخلايا الظهارية والتصوير الحي لاحق من الفطري تفاعل الخلايا المناعية مع HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد في يرقات الزرد.

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

نحن نصف بروتوكولا للحث على الانتقال المرحلي للبروتين الرابط للحمض النووي TAR 43 (TDP-43) عن طريق الضوء في الخلايا العصبية الحركية الشوكية باستخدام سمك الحمار الوحشي كنموذج.

انتقال المرحلة البصرية من TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية الشوكية ليرقات حمار وحشي

يصف هذا العمل بروتوكولا لنظام التحوير المعياري Tol2 ، وهو طريقة استنساخ قائمة على البوابة لإنشاء وحقن تركيبات معدلة وراثيا في أجنة الزرد.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

يمكن أن يكون التلاعب البصري الوراثي لمسارات الإشارات استراتيجية قوية للتحقيق في كيفية فك تشفير الإشارات في التطور والتجديد والتوازن والمرض. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عملية لاستخدام منشطات إشارات البروتين العقدي ومورفوجينيك (BMP) القائم على مجال استشعار الجهد الخفيف والأكسجين في جنين الزرد المبكر.

تنشيط الإشارات البصرية الوراثية في أجنة الزرد

يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

تعلم طريقة التحكم في التعبير الجيني بالضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 البصري الوراثي. يوفر هذا البروتوكول تحكمًا مكانيًا وزمنيًا دقيقًا للتفعيل الضوئي.

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

استكشف المزيد من الفيديوهات