تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

هذا البروتوكول مهم لأنه طريقة ذاتية المنشأ، أو نشطة بالضوء، لتحفيز التعبير الجيني، في كائن حي سليم. في حالتنا، جنين حمار وحشي. ميزة هذه التقنية، هو أنه يستخدم الضوء، كعامل تحريض، والذي يسمح للسيطرة دقيقة جدا، سباسيال والزمنية من التعريفي.

وسيكون هذا البروتوكول مفيدا لأي حالة يكون فيها التعبير الجيني غير القابل للانفعاط مفيدا. وهذا يشمل أشياء مثل تتبع النسب، والحصول على وظيفة المقايسات أو تجارب الإنقاذ. لتبدأ مع موقف لوحة LED بالنسبة لأطباق بيتري التي تحتوي على الأجنة لتقديم 1.5 مللي واط لكل سنتيمتر مربع قوة الضوء إلى عدة أجنة في وقت واحد.

لتقليل خطر تلف الصورة إلى منشط النسخ الخلفي، نشر الضوء على فترات ساعة واحدة على الخروج باستخدام تتابع مؤقت، إذا مضيئة لأكثر من ثلاث ساعات. إزالة أغطية طبق بيتري لتقليل تشتت الضوء من التكثيف. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على أجنة التحكم وصندوق مقاوم للضوء للتحكم في الظلام.

إزالة الأجنة من الإضاءة، بعد مدة التنشيط المطلوبة. لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي، استخدم عدة استخراج الحمض النووي الريبي. نقل الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر الدقيقة وإزالة الماء الزائد البيض.

بعد إضافة عازلة تحلل، تجانس الأجنة مع الآفات البلاستيكية. نقل lysate إلى عدة العمود المقدمة واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية الجيش الملكي النيبالي. تخزين الحمض النووي الريبي المنقى، في ناقص 20 إلى ناقص 80 درجة مئوية، حتى استخدام أو توليفها على الفور cDNA من ميكروغرام واحد، مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام عدة توليف cDNA، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

إضافة ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي في جدار رقيقة 0.2 ملليلتر، أنبوب PCR، التي تحتوي على أربعة ميكرولترات، من خمسة أضعاف مزيج التفاعل الرئيسي cDNA، تليها إضافة ميكرولتر واحد، من 20 مرة عكس محلول إنزيم النسخ. المقبل تشكل حجم النهائي من 20 ميكرولتر، مع المياه الخالية من النيوكليز. وضع الأنبوب في دورة الحرارية المبرمجة لتوليف cDNA.

تخزين cDNA توليفها في ناقص 20 درجة مئوية حتى استخدام أو استخدامها على الفور للتقييم الكمي. إعداد ردود الفعل PCR الكمية التي تحتوي على مزيج رئيسي الإنزيم الأخضر السيبرانية. خمسة أضعاف الأقراص المدمجة المخففة وGFP التمهيدية في تركيز نانومولار 325 في ثلاثية الجسيمات وإجراء رد الفعل في جهاز PCR المبرمجة في الوقت الحقيقي.

عند الانتهاء من رد الفعل، وتحليل منحنى ذوبان لتحديد خصوصية رد الفعل. حساب التعريفي الضوء تنشيط كما أضعاف التغيير بالنسبة للأجنة التحكم باستخدام طريقة مزدوجة دلتا CT. واستخدام البرامج الإحصائية لتحديد أهمية.

بعد إزالة الأجنة من الإضاءة، شل الأجنة للتصوير في 3٪ ميثيلسليلوز تحتوي على 0.01٪ Tricaine في شرائح الاكتئاب الزجاجي. احصل على صور مضانة و brightfield على مجهر ستيريو فلوري متصل بكاميرا رقمية باستخدام إعدادات فلتر GFP القياسية. دمج الصور مشرق وفلورسينس بعد الاستحواذ مع برامج معالجة الصور.

وأشار القياس الكمي لتعبير GFP إلى تحريض التعبير في أقرب وقت بعد 30 دقيقة من التعرض للضوء الأزرق. ثم استمرت مستويات التعبير عن GFP في الزيادة حتى ست ساعات ، بعد التنشيط باطراد. كما تم تقييم تحريض GFP نوعيا من خلال فحص كثافة الفلورسينس في نفس الوقت نقاط ما بعد التنشيط.

لوحظت لأول مرة مضان GFP فوق مستويات الخلفية في ثلاث ساعات بعد التنشيط وأصبحت أكثر إشراقا بشكل ملحوظ في ست ساعات بعد التنشيط. في المقابل السيطرة على الأجنة لجميع النقاط الزمنية، وأبقى في الظلام، لم تظهر، أي مضان GFP ملحوظ. يجب أن يكون ضوء التنشيط في النطاق الأزرق من طيف الضوء المرئي.

يحتوي كل من ضوء الغرفة وأشعة الشمس على بعض الضوء الأزرق. لذا احرص على حماية عناصر التحكم السلبية من أي مصادر للضوء المحيط. نظام TAEL C120، مشفر وراثيا ووحدات ويمكن أن تدفع التعبير عن أي جين من الفائدة.

لذلك، جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، يمكن استخدامه للإجابة على مجموعة من الأسئلة البيولوجية.