بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)

يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (_5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.

دراسة بروتينات الأغشية المتكاملة في بيئتها الأصلية كانت تحديا بسبب تعقيد غشاء البلازما. الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة، أو GUVs، هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة خصائص الميمبران الحيوي، ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع البروتين أدرجت GUVs على أساس التأسيس التلقائي، بعد تورم الهيدروجيل. الطرق التقليدية لتصنيع GUVs ليست قابلة للتعميم لدمج بروتين الغشاء المتكامل. وغالبا ما تكون هذه الأساليب منخفضة الغلة ومعقدة منهجيا ومخصصة، ولا تنطبق على فئات واسعة من البروتينات. من ناحية أخرى، يمثل هذا البروتوكول طريقة مرنة وقوية وبسيطة لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة الوظيفية في GUVs.We أنجز هذا من خلال إعداد سقالة هيدروجيل، تحتوي على البروتين، وإيداع طبقة رقيقة من الدهون فوقه. في المثال المعروض هنا ، أدرجنا مستقبلات G المقترنة بالبروتين ، أو GPCR ، في الإماهة GUVs.Upon للنظام بأكمله ، برعم GUVs من سطح الهيدروجيل مع الغشاء الذي يحتوي على GPCRs.Allow موجهة بشكل صحيح جميع الكواشف أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت، تنظيف زلات الغطاء عن طريق وضعها في الميثانول و sonicating لمدة 30 دقيقة في 40