اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus

توفر التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب طريقة مباشرة للكشف عن التأثيرات في لعاب الحشرات. ومع ذلك، لم يتم وصف هذا بالتفصيل من قبل. هذا البروتوكول فعال لجمع اللعاب من الحشرات saprophytic.

بالإضافة إلى ذلك، إنها تقنية بسيطة، حيث نستخدم وسيطا يحتوي على السكروز فقط كحمية اصطناعية. قد يؤثر لعاب الحشرات الصابوروتية على الجهاز المناعي للمضيف لصالح سلوك التغذية ونقل مسببات الأمراض. هذا الدواء الذي يمكن استخدامه لسلوك الحشرات وبحوث مسار عظم الحشرات.

هذا هو أسلوب بسيط لتنفيذ. ومع ذلك ، فإن هذا يشير إلى تصاعد البيئة التجريبية النظيفة حيث يتم جمع اللعاب لمزيد من البحث. ابدأ بإعداد محلول السكروز بنسبة 5٪ للنظام الغذائي الاصطناعي ، وتصفية الحل من خلال فلتر 0.22 ميكرون لإزالة التلوث البكتيري والشوائب.

تجويع ما يقرب من 200 يرقات النطاط النباتي البني الصغيرة لمدة ثلاث إلى خمس ساعات قبل إدخالها إلى غرفة التغذية. بعد ذلك ، لإعداد الاسطوانات الزجاجية كغرف تغذية ، قم بتغطية نهاية مفتوحة للغرفة بغشاء البارافين قبل إدخال الحشرات التجريبية ، ثم نقل الحشرات إلى الأسطوانة الزجاجية وتغطي الطرف الآخر من الغرفة بغشاء البارافين الممتد. إضافة 200 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي على الغشاء، ثم تغطية السائل مع طبقة أخرى من غشاء البارافين امتدت.

وأخيرا، تغطية الغرفة مع رقائق الألومنيوم، وترك نهاية مع جهاز النظام الغذائي الاصطناعي يتعرض للضوء. بعد 24 ساعة ، اجمع لعاب SBPH عن طريق تبريد الأسطوانة في أربع درجات مئوية لشل حركة الحشرات ، ثم كشف الفيلم الخارجي وجمع النظام الغذائي الاصطناعي في أنابيب معقمة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة معقمة. الحفاظ على اللعاب التي تم جمعها في ناقص 80 درجة مئوية حتى التحليل.

بعد ذلك ، شطف الغشاء الداخلي مع 50 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي الطازج ثلاث مرات عن طريق الأنابيب بهدوء ، وجمع نظام الغسيل الاصطناعي في أنابيب معقمة 1.5 ملليلتر. بعد الشطف الثلاثة ، أضف نظاما غذائيا اصطناعيا طازجا على الغشاء الداخلي وضع غشاء البارافين المتمدد حديثا على القمة. وأخيرا، قم بتصفية العينات التي تم جمعها من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرون لإزالة الميكروبات والملوثات الأخرى.

نقل عينات اللعاب الجماعية في 500 ميكرولتر، 10 كيلودالتون فلتر الطرد المركزي. طرد مركزي العينة. جمع supernatant وإحضار الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر.

لقياس تركيز اللعاب المجمع، قم بتشغيل مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئي واغسل الطيات ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. حدد الخيارات على الشاشة بالترتيب التالي، البروتينات، البروتين A280. حدد نوع وحدة امتصاص واحدة تساوي مليغرام واحد لكل ملليلتر.

ثم حدد المربع لتصحيح خط الأساس، 340 نانومتر. بعد ذلك، قم بتحميل اثنين ميكرولتر من محلول مائي بنسبة 5٪sucrose كفراغ، ثم المس Blank في أسفل الشاشة. وأخيرا، بعد وضع المعايير، تحميل اثنين من ميكرولتر من اللعاب التي تم جمعها وتسجيل تركيز البروتين.

عند التغذية على 5٪ السكروز، نجا أكثر من 80٪ من SBPH لأول أربعة أيام. ومع ذلك، من اليوم الخامس فصاعدا، زادت الوفيات بسرعة إلى 40٪، وفي اليوم السابع، نجا أقل من نصف SBPH. أظهر تحليل صفحة SDS أن عينات اللعاب المركزة من لعاب SBPH المصاب ب RSV تحتوي على العديد من البروتينات أكثر من التحكم السلبي في السكروز بنسبة 5٪.

في تحليل لطخة غربية للكشف عن بروتين RSV capsid ، وهو حشرات غير مصابة وفيروليفيروس. تم الكشف عن بروتين RSV capsid بنجاح في العينة الفيروسية ، وهو جهاز مضاد مصمم ضد منتج الجين LssgMP اكتشف بروتين 78 كيلودالتون في عينات غير مصابة وفيرة ، مما يدل على أن LssgMP هو بروتين اللعاب. أظهر تحليل QRT PCR لمستويات نسخة LssgMP في الأنسجة المختلفة أن مستويات نسخة Lssg في الغدة اللعابية كانت أعلى بمقدار 20 ضعفا مما كانت عليه في الجسم والأمعاء بأكملهما ، مما يؤكد التعبير المحدد عن LssgMP في الغدة اللعابية.

تجويع الحشرات التجريبية قبل إدخالها إلى الغرفة أمر ضروري لضمان كفاءة جمع اللعاب لدينا. إلى جانب ذلك ، ينبغي جمع وسيلة اصطناعية وتبادلها كل 24 ساعة للحد من التلوث الميكروبي في العينة التي تم جمعها. توفر هذه التقنية طريقة مباشرة لدراسة وظيفة اللعاب في نقل مسببات الأمراض.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد في دراسة تفاعل مضيف مسببات الأمراض الحشرية.