قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع

هنا، يتم تقديم سير عمل تجريبي يمكن من الكشف عن معالجة caspase-8 مباشرة في مجمع الإشارات المسببة للوفاة (DISC) ويحدد تكوين هذا المجمع. هذه المنهجية لها تطبيقات واسعة النطاق، من كشف الآليات الجزيئية لمسارات موت الخلايا إلى النمذجة الديناميكية لشبكات موت الخلايا المبرمج.

يتم التوسط بدء موت الخلايا المبرمج عن طريق تفعيل caspases في منصات الجزيئية علامة. نقدم الكشف عن القرص مفتاح بدء موت الخلية المعقدة، والتي هي بمثابة منصة لتفعيل caspase-8. ميزة هذه التقنية هي أنها تسمح بالكشف عن التجميع وتكوين مجمع DISC إلى جانب توفير معلومات حول معالجة caspase-8 في هذا المجمع.

ابدأ التجربة مع الخلايا التي تتراوح نسبة التقاءها بين 80٪ و90٪، مع الالتزام بالطبق. تجاهل المتوسط وإضافة وسط جديد إلى الخلايا الملتصقة. ثم تحفيز الخلايا مع تركيز محدد من CD95L عن طريق عقد لوحة في زاوية وماسورة ليغاند في الوسط دون لمس الخلايا الملتصقة.

لحصاد الخلايا، ضع طبق الخلية على الجليد. إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة لتعليق الخلية وكشط الخلايا المرفقة قبالة لوحة. جمع تعليق الخلية في أنبوب 50 ملليلتر.

غسل طبق الخلية مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين وإضافة محلول الغسيل في نفس أنبوب 50 ملليلتر. ثم طرد تعليق الخلية في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. بعد التخلص من supernatant، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة.

ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة إنفاق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة مرة أخرى. كرر الطرد المركزي مرة أخرى، ثم إعادة تثبيت بيليه الخلية في ملليلتر واحد من العازلة تحلل واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد.

بعد الحضانة، والطرد المركزي lysate في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية، ثم نقل supernatant إلى أنبوب نظيف. تجاهل بيليه وجمع عينة 50 ميكرولتر من الليستر في أنبوب آخر لتحديد تركيز البروتين. لprecipitation المناعي، إضافة اثنين من microliters من الأجسام المضادة المضادة APO1 و 10 ميكرولتر من البروتين المعدة حبات سيفاروز إلى الليست.

إضافة 10 ميكرولتر من الخرز وحدها إلى أنبوب منفصل يحتوي على lysate لتكون بمثابة عنصر تحكم حبة. احتضان الخليط الذي يحتوي على الليسات والأجسام المضادة، وخرز البروتين A Sepharose بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف. في اليوم التالي، طرد مركزي الخليط في 500 مرة G لمدة أربع دقائق في أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من supernatant، وغسل الخرز عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة والتخلص من supernatant بعد الطرد المركزي. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل. بعد التخلص من غسل برنامج تلفزيوني الماضي، يستنشق الخرز ويفضل مع حقنة هاملتون 50 ميكرولتر.

لتنفيذ لطخة الغربية، إضافة 20 ميكرولتر من العازلة تحميل 4X إلى الخرز والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في وقت واحد، تسخين الضوابط lysate في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تحميل الlysates، مناعة، ومعيار البروتين على هلام SDS 12.5٪وتشغيل مع الجهد المستمر من 80 فولت.

بعد اكتمال تشغيل هلام، نقل البروتينات من هلام SDS إلى غشاء النيتروسليلوز. بعد اكتمال النقل ، ضع الغشاء الملطخ في صندوق واحتضانه لمدة ساعة في محلول الحجب تحت الهياج اللطيف ، ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBST. للكشف عن البروتينات، إضافة أول الأجسام المضادة الأولية في التخفيف المشار إليها إلى الغشاء واحتضانه بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف.

في اليوم التالي، اغسل الغشاء بثلاثة يغسل برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق، ثم احتضن الغشاء مع 20 ملليلتر من الأجسام المضادة الثانوية مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. غسل الغشاء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني مرة أخرى. بعد التخلص من غسل بي بي إس تي الأخير، أضف ما يقرب من ملليلتر واحد من ركيزة البيروكسيديداز الفجل إلى الغشاء وكشف إشارة الإضاءة الكيميائية.

أدى تحفيز خلايا HeLa-CD95 لسرطان عنق الرحم مع CD95L إلى مستوى عال من تكوين CD95 DISC الذي تم رصده عن طريق التكفير المناعي CD95. CD95، FADD، procaspase-8، بروكاسباس-10، وC-FLIPS لوحظت في هذه التخصصات المناعية CD95 تشير إلى تشكيل القرص كفاءة. تم الكشف عن منتجات الانقسام من p43-FLIP و p22-FLIP في التخصصات المناعية، مما يشير إلى تنشيط caspase-8.

HeLa-CD95 الخلايا التي عبر عن c-FLIP طويلة استخدمت لتحليل تشكيل القرص CD95. على غرار خلايا HeLa-CD95 الأبوية ، لم يتم الكشف عن أي تجنيد لبروتينات FADD و procaspase-9 و procaspase-10 و c-FLIP و PARP1 في النسيب المناعي من هذه الخلايا دون علاج CD95L. وتميزت الخلايا التائية الأولية المنشطة بمستويات عالية من CD95، و FADD، و procaspase-8، و procaspase-10، و c-FLIPS في البروكابات المناعية المضادة لل CD95.

تسمح هذه التقنية بتحليل تكوين القرص الجزيئي ، بما في ذلك معالجة caspase-8 في DISC. جميع خطوات الغسيل مهمة جدا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تؤخذ نقاط التحفيز وأوقات الحضانة على محمل الجد.

هذه هي الطريقة الوحيدة لقياس التجميع على مجمع القرص. ومع ذلك، لقياس تنشيط caspase-8، يمكن للمرء أيضا تنفيذ كاسباس-8 عمليات قياس النشاط. سمح لنا هذا النهج بالحصول على رؤى جديدة حول بدء موت الخلايا المبرمج.