تحضير كبسولات دقيقة متعددة الوظائف تعتمد على الحرير محملة ببلازميدات الحمض النووي المشفرة ل RNA Aptamers و Riboswitches

تكمن أهمية هذا البروتوكول في أنه يوفر وسيلة للحفاظ على عمل أجهزة الاستشعار المشفرة بالحمض النووي عن طريق تثبيت قوالب بلازميد الحمض النووي في كبسولات دقيقة متوافقة حيويا شبه منفذة. تقنية تثبيت الحمض النووي المقترحة متعددة الاستخدامات. يسمح بتصنيع أجهزة استشعار حيوية متعددة الوظائف بآليات تنشيط مختلفة في المختبر.

نتصور أن هذه الكبسولات الدقيقة ، إلى جانب عناصر الاستشعار المناسبة ، يمكن استخدامها لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة ، بما في ذلك إطلاق جزيئات الإشارات في بيئات مختلفة مثل الأغشية الحيوية والأعضاء. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة للأنظمة البيولوجية على المستوى الجزئي ، لا سيما كيف يمكن أن يؤثر تجميد الحمض النووي والازدحام الجزيئي على حركية وآلية تنشيط الجينات. ابدأ بترسب الطبقة الأولية من البولي إيثيلين على السيليكا القربانية ، أو SiO2 ، الجسيمات الدقيقة عن طريق إضافة مليلتر واحد من محلول البولي إيثيلين إلى 300 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر.

قم بتقليب الخليط على ThermoMixer بمعدل 800 دورة في الدقيقة في الظروف المحيطة. اجمع الجسيمات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي عند 0.2 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. بعد 15 دقيقة ، اغسل الجسيمات الدقيقة أربع مرات بمليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات الخالي من DNase و RNase عن طريق الطرد المركزي عند 0.2 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية بعد كل عملية طرد مركزي.

بعد ذلك ، اضبط تركيز بلازميدات الحمض النووي من 50 إلى 200 نانوجرام لكل ميكرولتر مع الماء المقطر الخالي من DNase و RNase ، واستخدم ملليلتر واحد من المحاليل المحضرة لترسيب الحمض النووي على الجسيمات الدقيقة المعدة بالبولي إيثيلين. قم بتقليب خليط الجسيمات الدقيقة برفق على ThermoMixer عند أربع درجات مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، ثم اجمع الجسيمات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي عند 0.2 جم لمدة دقيقة واحدة. ضع علامة على أنابيب بلازميدات الحمض النووي التي تشفر ثيوفيلين ريبوسوتش ، إلى جانب GFPa1 باسم ThyRS-GFPa1 ، وبلازميدات الحمض النووي التي تشفر أبتامر البروكلي ك BrocApt.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، واغسل الجسيمات الدقيقة أربع مرات بمليلتر واحد من الماء المقطر الخالي من DNase و RNase كما هو موضح سابقا ، وتخلص من المادة الطافية بعد كل طرد مركزي. لترسيب طبقة الفيبروين الحريرية ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الفيبروين الحريري المائي المعاد تكوينه إلى الجسيمات الدقيقة الممتصة بالحمض النووي ، وقم بتحريك الخليط برفق على ThermoMixer عند 750 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 10 درجات مئوية. اجمع الجسيمات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي ، ثم اغسلها مرة واحدة بمليلتر واحد من الماء المقطر الخالي من DNase و RNase ، كما هو موضح من قبل.

كرر الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 0.5 مل من الماء المقطر DNase و RNase ، واخلط الجسيمات الدقيقة عن طريق الدوامة. بعد ذلك ، عالج الجسيمات الدقيقة ب 0.5 مل من الميثانول بنسبة 100٪ عند 10 درجات مئوية لمدة خمس دقائق على ThermoMixer.

بعد جمع الجسيمات الدقيقة عن طريق الطرد المركزي ، قم بمعالجة الجسيمات بالميثانول بنسبة 100٪ على ThermoMixer بمعدل 750 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 10 درجات مئوية لتكوين صفائح بيتا. الطرد المركزي للخليط عند 0.2 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية لجمع الجسيمات الدقيقة قبل غسل الجسيمات مرتين بمليلتر واحد من الماء المقطر الخالي من DNase و RNase كما هو موضح من قبل. قم بإذابة نوى SiO2 للجسيمات الدقيقة عن طريق إضافة محلول حمض الهيدروفلوريك بنسبة 8٪ إلى الجسيمات الدقيقة ذات القشرة الأساسية المحببة.

نقل محاليل الجسيمات الذائبة إلى أجهزة غسيل الكلى ، وتحويلها بالكلى ضد الماء منزوع الأيونات في دورق بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة ملليلتر واحد لتجميع معلق الكبسولات الدقيقة الحريرية من أجهزة غسيل الكلى إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة ملليلتر. انقل 100 ميكرولتر من عينة الكبسولة الدقيقة إلى بئر واحد من شرائح زجاجية مكونة من ثماني آبار ، واترك الكبسولات تترسب لمدة 20 إلى 30 دقيقة قبل التصوير باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، أو CLSM.

ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الكبسولات في كل بئر من شريحة زجاجية ذات غرفة. إلى كل بئر ، أضف بالتتابع 300 ميكرولتر من محلول الفلوروفور بأوزان جزيئية متفاوتة من الأدنى إلى الأعلى. اخلطي الخليط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، واتركي الخليط يحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة حتى يصل انتشار محاليل الفلوروفور إلى التوازن.

في وقت لاحق ، انقل الشريحة إلى CLSM لتصوير كل بئر باستخدام هدف غمر الزيت 100x بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر. حدد منطقة الاهتمام عن طريق ضبط المستوى البؤري ، وركز على الكبسولات التي تظهر على شكل دوائر ذات قطر أكبر. قم بإجراء تفاعل النسخ / الترجمة في المختبر عن طريق إضافة المكونات الخالية من الخلايا بالتتابع إلى عينة من الكبسولات الدقيقة واحتضان الأنبوب عند 30 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

تحقق من التألق على قارئ اللوحة باستخدام الطول الموجي للإثارة عند 488 نانومتر وانبعاث مرشح GFP / FITC عند حوالي 510 نانومتر. أخيرا ، قم بتصوير الكبسولات الدقيقة الحريرية على نظام CLSM باستخدام الليزر عند 488 و 561 نانومتر. في الدراسة ، تم إنتاج أغطية ميكرو ليفروين حريرية قوية بحجم متجانس يبلغ حوالي 4.5 ميكرومتر وسمك قشرة يبلغ حوالي 500 نانومتر.

تم تحليل نفاذية قذائف كبسولة الفيبروين الحريرية المجوفة باتباع طريقة قطع الوزن الجزيئي. تؤدي الزيادة في تركيز طبقة البولي إيثيلين الأولية إلى زيادة الاستقرار الغروي للكبسولات الدقيقة ذات الأصداف الأكثر نفاذية ، بينما يؤدي القضاء على الطبقة الأولية إلى تراكم الكبسولات ذات أغشية القشرة الأقل نفاذية. كشفت حركية تعبير GFPa1 أثناء تنشيط ThyRS عن تنشيط جيني GFPa1 أعلى من بلازميدات الحمض النووي المحملة في كبسولات حريرية دقيقة من التحكم في الحمض النووي غير المغلف.

في التحليل التمثيلي ، يتم عرض صور CLSM لكبسولات الحرير الفيبروين المحملة ب 32 نسخة من الحمض النووي لكل كبسولة قبل وبعد الحضانة في النسخ المختبري ، يتم عرض نظام الترجمة. أظهرت ملامح شدة المقطع العرضي لكبسولات الحرير الفيبروين التعبير عن GFPa1. تمت مقارنة حركية النسخ ل 20 كبسولة حريرية دقيقة ذات طبقات محملة ب 30 نسخة من الحمض النووي لكل كبسولة مع الحمض النووي غير المغلف بالسيطرة.

أكدت إشارة الإخراج الأعلى من كبسولات الحرير الدقيقة مقارنة بعينات الحمض النووي غير المغلفة بتركيزات مكافئة فعالية كبسولات الحرير الدقيقة. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تطبيق العديد من تقنيات الفحص المجهري عالية الدقة على تشابك الحمض النووي للصورة في الحالة المشمولة وعملية تنشيط الجينات المنفصلة في المختبر. يمكن تطبيق هذه التقنية للإجابة على ديناميكيات المستوى الجزيئي في الحد الأدنى من الخلايا الاصطناعية.

على وجه التحديد ، عندما تقترن بعناصر جينية مناسبة ، يمكن استخدام الكبسولات الدقيقة لدراسة الاتصال من خلية إلى خلية.