قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

يقوم هذا البروتوكول بتشريح الخواص الميكانيكية الفردية لنواة الخلية التي تجعلها مقياسا ميكانيكيا لاستقطاب الخلايا وتمايزها وهجرتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تقيس الخواص الميكانيكية وتطبق القوى على المقصورات تحت الخلوية دون اضطراب خارجي في الغشاء أو الهيكل الخلوي القشري. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لمعالجة الخرز داخل الخلايا الأخرى للكائنات الحية الأخرى من أجل دراسة الميكانيكا النووية في خطوط الخلايا المختلفة أو النماذج الحيوانية.

تعد محاذاة مستشعر القوة المباشرة أمرا بالغ الأهمية لالتقاط كل الضوء الذي يخلق ويخرج من الفخاخ البصرية. سيضمن ذلك قياسات دقيقة لزخم الضوء في الوسط اللزج المرن للخلية. ابدأ التحضير للخلية الواحدة عن طريق وضع أجنة المرحلة الكروية بعد أربع ساعات من الإخصاب في طبق زجاجي يحتوي على وسائط E3 باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.

ثم حدد الأجنة الإيجابية للخرز وعبر عن بروتين الفلورسنت في حالة حقن الحمض النووي الريبوزي المرسال. استخدم الملقط لنزع الأجنة يدويا ونقل ما يقرب من 10 إلى 15 جنينا ممزقا إلى حاوية تفاعل 1.5 ملليلتر بمساعدة ماصة باستور زجاجية. قم بإزالة وسائط E3 من الأنبوب وأضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الأنسجة المستقل عن ثاني أكسيد الكربون الذي تم تسخينه مسبقا.

هز الأنبوب بلطف لتجنب تكوين الفقاعة وتأكد من أن محتويات الأنبوب تصبح عكرة حيث تنفصل الخلايا دون وجود أجزاء كبيرة مرئية من العين. ثم طرد مركزي الأنبوب عند 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وجمع الكريات للمضي قدما في تلطيخ الخلايا.

لتسمية النواة ، أعد تعليق الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول تلطيخ صبغة الحمض النووي Hoechst الطازج إلى الأنبوب. احتضن الخلايا الملطخة لمدة سبع دقائق في الظلام. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا مركزيا كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الكريات إما في 50 ميكرولتر من DMEM للعينات المعلقة أو 20 ميكرولتر من DMEM للخلايا في الحبس.

لإعداد الزخارف البصرية أو غرفة OT للتجارب مع الخلايا المعلقة ، قم بقطع قطعة من الشريط الاسكتلندي على الوجهين بثقب مربع يبلغ حوالي 10 ملليمترات × 10 ملم في الوسط. قشر إحدى الطبقات الواقية من الشريط وضع الجانب المكشوف من الشريط في وسط طبق سفلي زجاجي رقم 1.5 H. اضغط على الشريط بلطف لجعل كل سطح الشريط يلتصق بالزجاج مع تجنب فقاعات الهواء وتقشير الطبقة الواقية المتبقية من الشريط.

احتضن السطح ب 100 ميكرولتر من Concanavalin A بمعدل 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة قطرة Concanavalin A واشطف السطح باستخدام DMEM. أضف 30 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الخلايا على سطح التجويف.

ثم أغلق الغرفة بلطف شديد باستخدام زجاج غطاء 22 × 22 ملم. استخدم مشرط أو ملقط إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، تابع بدء تشغيل الملقط البصري عن طريق تشغيل الليزر بطاقة عالية إلى حد كبير لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة لتحسين استقرار طاقة الإخراج.

عند الانتهاء ، قم بتشغيل وحدة الإلكترونيات الخاصة بوحدات المعالجة الدقيقة البصرية وقياس القوة. قبل محاذاة مستشعر القوة البصرية ، ضع قطرة من الماء على هدف الغمر بالماء 60X 1.2 ووضع الغرفة التي تحتوي على الخلايا على المسرح. ركز على السطح السفلي للغرفة حيث سيتم وضع عينات الخلية.

بعد إضافة قطرة من زيت الغمر أعلى شريحة الغطاء الزجاجية التي تغطي العينة، اخفض عدسة التجميع الخاصة بوحدة مستشعر القوة حتى تتلامس مع قطرة الزيت. باتباع الإجراء القياسي لمحاذاة مستشعر القوة البصرية، انظر إلى صورة مستوى العينة على الكاميرا الإضافية لاستخدامها في وضع OTs، ثم اخفض مستشعر القوة البصرية حتى يظهر توقفه الميداني مقترنا بمستوى العينة. للتحقق من وجود فقاعات هواء باستخدام عدسة برتراند، راقب مسار التصوير من خلال الكاميرا الإضافية.

إذا كانت هناك أي أوساخ أو فقاعات هواء مرئية، فقم بتنظيف العدسة والغرفة باستخدام أنسجة عدسة خالية من الغبار قبل تكرار الإجراء كما هو موضح، مع إضافة المزيد من زيت الغمر. باستخدام البراغي الجانبية الموضوعة على حامل مستشعر القوة البصرية ، قم بتوسيط توقف المجال في مجال الرؤية. للحصول على الدقة، افتح نقطة التوقف الميدانية تقريبا لشغل مجال الرؤية المرئي على الكاميرا الإضافية.

بعد وضع العينة في المجهر ومحاذاة مستشعر القوة البصرية ، استخدم لوحة نصف الموجة الدوارة لتعيين قوة المصيدة الأولية إلى 200 مللي واط إذا لم تكن صلابة النواة أو البنية بين الخلايا التي تم فحصها معروفة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، استخدم وحدة التحكم في برنامج مرحلة المجهر للبحث عن خلية بها حبة واحدة أو حبتان من خلال الفحص المجهري Brightfield المنقول. في الورقة العددية ، اكتب الإزاحة ووقت كل خطوة مسار لاحقة.

بدلا من ذلك ، قم بتحميل الجدول S1 من المواد التكميلية. لتجربة الإجهاد / الاسترخاء ، قم ببرمجة الأحمال شبه المنحرفة ليتم تطبيقها. في برنامج OT ، قم بتنشيط الفخاخ البصرية.

لمحاصرة المجهر ، اضبط مستويات الصورة فوق الخرزة قليلا باستخدام وحدة تحكم في برنامج مرحلة المجهر. انقر على ميكروبيد البوليسترين في نافذة تصوير الكاميرا الإضافية المعايرة. الحبس الناجح للحبة بواسطة المصيدة البصرية سيقلل بشدة من حركة الخرزة.

انقر واسحب الخرزة عبر السيتوبلازم وضعها على مسافة ميكرون تقريبا من الغلاف النووي. تأكد من تعيين المسار بحيث تكون المسافة البادئة للحبة عمودية على الغشاء النووي. عندما يكون الإعداد جاهزا ، انتقل إلى برنامج التصوير وانقر فوق زر الاكتساب لبدء الحصول على الصورة.

افتح نافذة القراءة القسرية في الوقت الفعلي ، وانقر فوق البيانات ، واحفظ في نافذة قراءة القوة في الوقت الفعلي للحفظ. بدء بيانات موضع الملائمة وقياس القوة. ابدأ المسار الذي تم تحميله مسبقا بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخرزة وتحديد مسار البدء.

انتظر حتى يتم الانتهاء من المسار ويستقر النظام قبل الانتهاء من تسجيل بيانات قياس قوة المصيدة. توقف عن الحصول على الصور وقم برسم النتائج في برنامج ما بعد المعالجة. في التحليل التمثيلي ، يتم عرض خلية جذعية سلف الزرد المعزولة مع ميكروسفير واحد بالقرب من النواة.

تم رصد توزيع المجهر البوليسترين بعد خمس ساعات من الحقن داخل الجنين. تظهر صورة برايتفيلد والتألق أن الخرز منتشر عبر أنسجة الجنين. يؤكد الإسقاط الأقصى لمكدس Z الفلوري البؤري والحد الأقصى لإسقاط مكدس فرعي في نفس المنطقة أن جزءا كبيرا من الخلايا العميقة يحتوي على حبة واحدة إلى خرزتين.

في 24 ساعة بعد الإخصاب ، تم توزيع الخرز على كامل جسم الجنين. تم الحصول على الصور المجهرية برايتفيلد للخلايا المعلقة على الخلايا المحصورة مع واحد أو اثنين من الخرز المحقون. علاوة على ذلك ، سهلت العديد من الملصقات الفلورية التحقيق في جوانب مختلفة من الخلايا ، مثل الغشاء بين النواة ، وغشاء البلازما ، والحمض النووي ، والخط المعدل وراثيا.

وصفت اللقطات التمثيلية النوى التي تحمل علامة Hoechst قبل خمس ثوان / أثناء وخمس ثوان بعد المسافة البادئة باستخدام ميكروسفير محاصر بصريا. تمت دراسة ملامح الكثافة على طول جزء المسافة البادئة لثلاثة إطارات ومسارات مختلفة للحدود البعيدة والقريبة للنواة أثناء تجربة المسافة البادئة للخلايا المعلقة والمحصورة. تم قياس المسار المحاصر والقوة التي شهدها المجهر المحاصر بصريا خلال تجربة المسافة البادئة النووية المتكررة.

وأكدت ميكانيكا النواة في الزنازين المعلقة وتحت الحبس أن الحبس أدى إلى توسع في المساحة المتوقعة وتغير ضئيل في الصلابة النووية. إذا تم حقن الخرز في جنين مرحلة الخلية الواحدة ، فمن المرجح أن يتم توزيعه بالتساوي في المراحل اللاحقة. تذكر أن الخرزة يجب أن تكون محاصرة بثبات.

إذا هربت الخرزة من المصيدة البصرية ، فأعد تعريف المسار أو قم بزيادة طاقة الليزر. يمكن إجراء هذه التجارب بسهولة على حبيبات دقيقة متعددة داخل خلية واحدة وتمتد إلى قياسات ميكرورولوجيا نشطة.