الأنسجة المعالجة بالفرز الإشعاعي للخلايا المنشطة بالتألق (FACS-RTT) لتحديد الأصل الخلوي للإشارة المشعة

هذا البروتوكول مكمل للتصوير في الجسم الحي. يسمح بنوع الخلية والمستوى الخلوي لتحديد كمية المقتفيات الإشعاعية ، وهو مقياس مختلف عن المقياس الذي تم الحصول عليه في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي حساسيتها والدقة الخلوية التي يوفرها استخدام الوصلات المشعة وفرز الخلايا.

قم بتشغيل الكاميرا وتحميل برنامج التشغيل. انقر فوق زر المرحلة Home XYZ لأداء التوجيه الموجه. قم بإعداد التجربة المكونة من اكتساب مسح ضوئي واحد لمدة 10 دقائق.

اضبط وضع الخطوة على ما يرام ووضع الاكتساب على وضع القائمة لتسجيل طيف الانبعاثات بأكمله. قم بإعداد السرير وتأكد من أن نظام الاحترار ومستشعر التنفس والتخدير وظيفي وآمن. ثم ، ضع شبحا حيث سيتم وضع رأس الحيوان.

اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات للأبعاد الثلاثة بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن حجم المسح الضوئي للشبح والحيوان هو نفسه. ابدأ الفحص الوهمي للمعايرة اللاحقة باستخدام المعلمات المحددة مسبقا.

ضمان العمل في بيئة مناسبة ، مصرح بها للتجارب التي تنطوي على نشاط إشعاعي. احتضان 100 ميكروغرام من سلائف تريبوتيلين في 100 ميكرولتر من حمض الخليك مع يوديد الصوديوم وخمسة ميكرولترات من 37٪ من حمض الباراسيتيك عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في دورة حرارية موضوعة في صندوق قفازات. قم بتخفيف التفاعل باستخدام 50٪ أسيتونيتريل في الماء للوصول إلى حجم 500 ميكرولتر.

حقن 500 ميكرولتر من التفاعل المخفف في عمود الطور العكسي. اعزل CLINDE باستخدام HPLC متدرج خطيا يمتد من 5 إلى 95٪ ACN في حمض الفوسفوريك سبعة ملليمولار لمدة 10 دقائق. قم بتخفيف العزل في الماء للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 ملليلتر ثم حقن التفاعل المخفف في عمود تركيز.

قم بإخراج CLINDE من العمود مع 300 ميكرولتر من الإيثانول المطلق ثم تبخر الإيثانول عن طريق احتضانه في جهاز طرد مركزي فراغي في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. قم بتخفيف البقايا التي تحتوي على CLINDE في 300 ميكرولتر من المياه المالحة لإنشاء محلول مخزون. بعد قياس نشاطه الإشعاعي ، قم بتخفيف محلول المخزون في محلول ملحي للحصول على محلول 0.037 megabecquerel في 500 ميكرولتر.

قم بإنشاء منحنيات المعايرة باستخدام المركبات المرجعية الباردة وحل معادلة الانحدار الخطي:Y تساوي AX زائد B للحصول على معاملات A و B. يمثل X كتلة المركب البارد ، ويمثل Y المساحة تحت المنحنيات. تحقق من المنطقة تحت منحنى الرباط الإشعاعي ، وقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 450 نانومتر بناء على منحنى المعايرة والمنطقة تحت منحنى الرباط الإشعاعي.

تقدير الكتلة وقياس نشاط الرباط الإشعاعي. تأكد من أن النشاط المحدد أكبر من 1000 جيجا بيكوريال لكل ميكرومول. انقر فوق الزر "تحديث الصورة" لتحديث موضع الحيوان.

اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تحريك المؤشرات بمساعدة الصور الثلاث في الجزء السفلي من الشاشة للأبعاد الثلاثة. قم بإعداد التجربة على مسح ضوئي مدته 60 دقيقة يتكون من 60 إطارا لمدة دقيقة واحدة. أعد استخدام كافة المعلمات الأخرى التي تم إعدادها في البداية.

حقن 500 ميكرولتر من المقتفي الإشعاعي المشع ثم اغسل الأنبوب ب 300 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪. في الوقت نفسه ، انقر فوق بدء الاستحواذ لبدء الفحص. افتح برنامج إعادة بناء الفحص ثم افتح مجموعة البيانات، وابحث عن ملف معلمات اسم الملف الذي تم إنشاؤه في مجلد الفحص.

حدد النظير محل الاهتمام. لاحظ أن معلمة وضع القائمة تسمح باختيار نظائر متعددة في هذه الخطوة. قم بتعيين معلمات إعادة الإعمار المختلفة مثل حجم voxel وعدد المجموعات الفرعية والتكرارات كما هو موضح في المخطوطة.

حدد تنسيق الإخراج ك NIFTI ثم حدد بدء إعادة إنشاء SPECT. استخدم ملعقة معدنية مسطحة وشفرة حلاقة لتشريح المناطق التي تهم الدماغ. ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين وقم بوزن الأنسجة التي تم الحصول عليها.

ضع العينات في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين مع ملليلتر واحد من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ثم جهاز طرد مركزي بسرعة 300 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الفائقة دون إزعاج الكرية. أضف 1،900 ميكرولتر من الإنزيم امزج واحدا واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق. أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم اثنين.

حرك بلطف باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ذهابا وإيابا 30 مرة. ثم ، احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء تحريك الأنابيب عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق. اخلطي بلطف ذهابا وإيابا باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ثم ماصة سعة 10 ميكرولتر قبل احتضان الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الأنسجة.

قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلايا 70 ميكرومتر وأضف 10 ملليلتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. لاستنفاد المايلين ، أعد تعليق الكريات مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ثم أضف 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين قبل الحضانة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

أضف خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وأجهزة الطرد المركزي 300 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وضع الكريات المعلقة في عمود المجال المغناطيسي. اغسل العمود بملليلتر واحد من المخزن المؤقت لإزالة المايلين أربع مرات.

جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. دوامة لفترة وجيزة لفصل الخلايا وإضافة خمسة ميكرولترات من Fc Block CD32. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

جهاز طرد مركزي عند 350 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant دون إزعاج الكرية. لطخة الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة ، ثم إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وكرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ولطخ الأنابيب رأسا على عقب على ورق ناعم. أعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من PBS المعقمة وانتقل مباشرة إلى فرز الخلايا.

أظهر فحص SPECT في الجسم الحي للفئران من النوع البري ارتباطا أعلى ل CLINDE في موقع حقن عديد السكاريد الشحمي مقارنة بالمنطقة المقابلة الجانبية من الدماغ. كشفت العينات خارج الجسم الحي التي خضعت لفرز الخلايا المشعة بالفلور ، أو FACS-RTT ، عن وجود عدد أكبر من مواقع ربط CLINDE فقط في الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على أن الأصل الخلوي لإشارة CLINDE في الجانب الجانبي من الدماغ كان microglia. كانت الزيادة في بروتين ناقل الحركة ، أو ربط TSPO ، في 12 شهرا في الفئران TgF344-AD مقتصرة على الخلايا النجمية.

في الفئران البالغة من العمر 24 شهرا ، لوحظت الزيادة في ربط TSPO بسبب كل من التغيرات النجمية والدبقية الصغيرة. في الفئران القديمة TgF344-AD ، أظهرت الخلايا النجمية المخططة كثافة منخفضة 5HT2AR بالمقارنة مع النوع البري. لوحظ وجود فرط في التعبير القشري ل TSPO في كل من الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة لموضوعات AD مقارنة بالضوابط المتطابقة مع العمر عندما تم إجراء FACS-RTT على عينات ما بعد الوفاة البشرية AD.

عند العمل مع النشاط الإشعاعي ، اتبع تعليمات الحماية من الراديو وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. ثم ، بعد الإجراء ، تأكد من تطهير بيئة العمل. يمكن بسهولة إجراء تحديد كمية البروتين وتحليل التعبير الجيني بعد هذا الإجراء على مجموعات الخلايا المعزولة.