تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي

تم تصميم هذه البروتوكولات لنموذج الآثار المختبرية لاستخدام الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم الرئة لمرضى التليف الكيسي. تم تصميم هذه الوصفة الإعلامية لتعكس التركيب الفسيولوجي للسبغم للأشخاص الذين يعيشون مع التليف الكيسي. عملية التجنيب يدخل القدرة على الثقافة في ظل ظروف الأكسجين المختلفة.

تسمح التعديلات على متوسط البلغم الاصطناعي بمحاكاة أمراض الرئة المزمنة الأخرى ونموذج المجتمعات الميكروبية في ظروف أخرى ، مثل تركيزات الجلوكوز المختلفة في التليف الكيسي المتزامن ومرضى السكري. نظرة عامة على الخطوات لإعداد المتوسط البلغم الاصطناعي يظهر خلط ASCM المعدة، ASMM و ASBM. يستخدم العازلة المماسح لtirate درجة الحموضة إلى 6.3 ويتم تصفية التعقيم من المتوسطة في غرفة باردة على شاكر المداري.

لتبدأ، وإعداد المتوسط البلغم الاصطناعي بإضافة 250 ملليلتر من ASCM إلى زجاجة لتر واحد يحتوي على ASMM. ثم أضف 250 ملليلتر من ASBM إلى الزجاجة المتوسطة. يتوسط الوسط مع حاجز ممسحة ضرس أساسي للوصول إلى درجة الحموضة 6.3 على ورقة درجة الحموضة.

تبريد المتوسط البلغم الاصطناعي في أربع درجات مئوية حتى الترشيح. ثم لبدء عملية الترشيح، نقل 200 ملليلتر من المتوسط البلغم الاصطناعي غير المصفاة إلى نظام الترشيح فراغ مع مرشح حجم المسام 0.22 ميكرومتر. بعد ربط نظام الترشيح بمضخة الفراغ ، قم بتشغيل مضخة الفراغ ، ثم ضع الغرفة على شاكر مداري ، تهتز بمعدل 90 دوران في الدقيقة في غرفة باردة عند أربع درجات مئوية.

تغيير عامل التصفية بعد 350 ملليلتر من المتوسط يحصل تصفيتها للتغلب على مشكلة انسداد. بعد تصفية كمية كبيرة، في 150 ملليلتر إضافية المتوسطة للترشيح. كرر الترشيح مع غرف إضافية حتى تتم تصفية جميع الوسائط.

نظرة عامة على تجنيب الأكسجين مما يدل على إضافة البلغم المريض إلى المتوسط البلغم الاصطناعي في زجاجة مصل autoclaved. ثم يجنب زجاجة المصل مختومة مع خليط الغاز. وأخيرا، يتم احتضان زجاجة المصل للحصول على الثقافة أليك واتس في الفاصل الزمني 24 ساعة لتسلسل الجينوم الفوقية اللاحقة.

لبدء تجنيب ثقافة زجاجة المصل ، ملصق 500 ملليلتر زجاجات مصل autoclaved مع معرفات العينة ، وتاريخ ووقت التطعيم والنسبة المئوية للأوكسجين المستهدفة. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 24 ملليلتر من متوسط البلغم الاصطناعي إلى كل زجاجة مصل يتم إعدادها. للحصول على حجم عينة كافية لكل حالة من الحالات الثقافية، إذا لزم الأمر، تمييع العينة مع الفوسفات المعقم العازلة المالحة، ثم البلغم المتجانس مع إبرة قياس 18 وإضافة ملليلتر واحد من البلغم المريض إلى كل زجاجة مصل.

بعد ذلك ، باستخدام ملاقط معقمة ، ضع سدادات المطاط المعبأة تلقائيا على الجزء العلوي من كل زجاجة مصل ، واضغط على سدادات المطاط دون لمس الجانب السفلي من السدادة. بعد إزالة الزجاجات من غطاء محرك السيارة، وتطبيق وتجعيد الأختام الألومنيوم. إزالة محور الأختام ومسح أسفل الجزء العلوي من الزجاجات مع مسح الكحول وتمرير ختم زجاجة من خلال لهب الموقد بونسن.

الآن إصلاح معقمة، 18 إبرة قياس لحقنة قائمة المكبس مع مرشح، إدراج حقنة إطلاق الغاز الملصقة في زجاجة أولا. الآن إصلاح معقمة، 18 إبرة قياس إلى إخراج الغاز من النظام وإدراج إبرة إخراج الغاز في زجاجة كذلك. توجيه تقاطعات T من الخزانات من خلال رصد الأكسجين.

بعد التحقق من تركيز الأكسجين المستهدف المتدفق عبر النظام ، استهدف ما يقرب من خمسة لترات في الدقيقة من تدفق الغاز. إعادة توجيه تقاطعات T من الخزانات إلى إنتاج الغاز. كما يبدأ الغاز في التدفق من خلال زجاجة المصل، وإيلاء اهتمام وثيق لقياس الضغط، وإذا زاد الضغط بشكل غير متوقع، وإغلاق النظام على الفور.

بعد تشغيل، والأوكسجين من خلال تجنيب زجاجة المصل لمدة دقيقة واحدة في خمسة لترات في الدقيقة الواحدة، وإعدادات تسمح ل10 التبادلات الجوية وضمان الغلاف الجوي الداخلي يصل إلى التركيز المطلوب من الأكسجين 100٪. إزالة إطلاق الغاز، 18 إبرة قياس. بعد السماح للضغط في زجاجة المصل لبناء إلى جو واحد، على الفور إزالة إبرة إخراج الغاز.

احتضان زجاجات المصل في 37 درجة مئوية حاضنة شاكر في 150 تناوب في الدقيقة الواحدة لمدة 3، 24 ساعة فترات. يتم أخذ أليك واتس في كل فاصل زمني 24 ساعة لتحليل المصب ويتم إعادة تدريج العينات في كل مرة. يوضح المثال هنا كيف قد تبدو الثقافة قبل وبعد الحضانة.

تم قياس مستويات الأكسجين ودرجة الحموضة الخارجة على مدار عملية زراعة عينات البلغم التي تم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. مع كل من فترات التجنيب من 12 ساعة و 24 ساعة، تم الحفاظ على تركيزات الأكسجين تقريبا مع مرور الوقت مع انخفاض معتدل في تركيز الأكسجين لوحظ لجميع الشروط الثلاثة. وكانت مستويات الحموضة المقاسة ضمن النطاق الفسيولوجي دون أي تغييرات كبيرة مع مرور الوقت.

وكشفت مقارنة الحمل الميكروبي والتنوع وتكوين المجتمع بين البلغم غير المستزرع والمثقف عن زيادة قدرها 20 ضعفا في الحمل الميكروبي في البلغم المستزرع. وأشارت مقاييس التنوع إلى الحفاظ على تكوين المجتمع المحلي مع الحد الأدنى من الاختلافات العالمية التي أدخلتها عملية الثقافة. تم إجراء تحليل مقارن للأنواع الميكروبية ال 120 في البلغم المستزرع وغير المستزرع من خلال التسلسل الجينومي الفوقي.

وقد تم تحديد 46 نوعا من هذه الأنواع في عينات غير مزرعة ومثقفة على حد سواء. وفي حين تم تحديد 35 منها حصرا في عينات غير مثقفة، تم تحديد 39 منها حصرا في عينات مثقفة. تم إنشاء منحنيات النمو القائمة على ماصة لمسببات الأمراض الرئة CF المشتركة المستزرعة في وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي من عزل عينة المريض تحت تركيز الأكسجين العادي 21٪.

لم يحدث أي تغيير مع مرور الوقت في الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في ASM فقط التحكم السلبي أشار إلى ثقافة خالية من التلوث. لوحظت أنماط منحنى النمو النموذجية التي تشير إلى أنه يمكن استخدام متوسط ASM لتوليد منحنيات النمو باستخدام الطرق البصرية. يتم استخدام التسلسل الميتاجنومي هنا لوصف تكوين المجتمع الميكروبي.

ويمكن استخدام تقنيات أخرى مثل التسلسل الميتاترانوبتومي لتقييم التعبير الجيني أو المستقلب لتقييم إنتاج المستقلب.