تصميم وتطوير نموذج لدراسة تأثير الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم مجرى الهواء التليف الكيسي
August 3rd, 2021
الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير نظام نموذجي لتأثير فرط الأكسجين على المجتمعات الميكروبية التليف الكيسي مجرى الهواء. المتوسط البلغم الاصطناعي يحاكي تكوين البلغم، وظروف زراعة فرط الأكسجين نموذج آثار الأكسجين التكميلي على المجتمعات الميكروبية الرئة.
تم تصميم هذه البروتوكولات لنموذج الآثار المختبرية لاستخدام الأكسجين التكميلي على ميكروبيوم الرئة لمرضى التليف الكيسي. تم تصميم هذه الوصفة الإعلامية لتعكس التركيب الفسيولوجي للسبغم للأشخاص الذين يعيشون مع التليف الكيسي. عملية التجنيب يدخل القدرة على الثقافة في ظل ظروف الأكسجين المختلفة.
تسمح التعديلات على متوسط البلغم الاصطناعي بمحاكاة أمراض الرئة المزمنة الأخرى ونموذج المجتمعات الميكروبية في ظروف أخرى ، مثل تركيزات الجلوكوز المختلفة في التليف الكيسي المتزامن ومرضى السكري. نظرة عامة على الخطوات لإعداد المتوسط البلغم الاصطناعي يظهر خلط ASCM المعدة، ASMM و ASBM. يستخدم العازلة المماسح لtirate درجة الحموضة إلى 6.3 ويتم تصفية التعقيم من المتوسطة في غرفة باردة على شاكر المداري.
لتبدأ، وإعداد المتوسط البلغم الاصطناعي بإضافة 250 ملليلتر من ASCM إلى زجاجة لتر واحد يحتوي على ASMM. ثم أضف 250 ملليلتر من ASBM إلى الزجاجة المتوسطة. يتوسط الوسط مع حاجز ممسحة ضرس أساسي للوصول إلى درجة الحموضة 6.3 على ورقة درجة الحموضة.
تبريد المتوسط البلغم الاصطناعي في أربع درجات مئوية حتى الترشيح. ثم لبدء عملية الترشيح، نقل 200 ملليلتر من المتوسط البلغم الاصطناعي غير المصفاة إلى نظام الترشيح فراغ مع مرشح حجم المسام 0.22 ميكرومتر. بعد ربط نظام الترشيح بمضخة الفراغ ، قم بتشغيل مضخة الفراغ ، ثم ضع الغرفة على شاكر مداري ، تهتز بمعدل 90 دوران في الدقيقة في غرفة باردة عند أربع درجات مئوية.
تغيير عامل التصفية بعد 350 ملليلتر من المتوسط يحصل تصفيتها للتغلب على مشكلة انسداد. بعد تصفية كمية كبيرة، في 150 ملليلتر إضافية المتوسطة للترشيح. كرر الترشيح مع غرف إضافية حتى تتم تصفية جميع الوسائط.
نظرة عامة على تجنيب الأكسجين مما يدل على إضافة البلغم المريض إلى المتوسط البلغم الاصطناعي في زجاجة مصل autoclaved. ثم يجنب زجاجة المصل مختومة مع خليط الغاز. وأخيرا، يتم احتضان زجاجة المصل للحصول على الثقافة أليك واتس في الفاصل الزمني 24 ساعة لتسلسل الجينوم الفوقية اللاحقة.
لبدء تجنيب ثقافة زجاجة المصل ، ملصق 500 ملليلتر زجاجات مصل autoclaved مع معرفات العينة ، وتاريخ ووقت التطعيم والنسبة المئوية للأوكسجين المستهدفة. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 24 ملليلتر من متوسط البلغم الاصطناعي إلى كل زجاجة مصل يتم إعدادها. للحصول على حجم عينة كافية لكل حالة من الحالات الثقافية، إذا لزم الأمر، تمييع العينة مع الفوسفات المعقم العازلة المالحة، ثم البلغم المتجانس مع إبرة قياس 18 وإضافة ملليلتر واحد من البلغم المريض إلى كل زجاجة مصل.
بعد ذلك ، باستخدام ملاقط معقمة ، ضع سدادات المطاط المعبأة تلقائيا على الجزء العلوي من كل زجاجة مصل ، واضغط على سدادات المطاط دون لمس الجانب السفلي من السدادة. بعد إزالة الزجاجات من غطاء محرك السيارة، وتطبيق وتجعيد الأختام الألومنيوم. إزالة محور الأختام ومسح أسفل الجزء العلوي من الزجاجات مع مسح الكحول وتمرير ختم زجاجة من خلال لهب الموقد بونسن.
الآن إصلاح معقمة، 18 إبرة قياس لحقنة قائمة المكبس مع مرشح، إدراج حقنة إطلاق الغاز الملصقة في زجاجة أولا. الآن إصلاح معقمة، 18 إبرة قياس إلى إخراج الغاز من النظام وإدراج إبرة إخراج الغاز في زجاجة كذلك. توجيه تقاطعات T من الخزانات من خلال رصد الأكسجين.
بعد التحقق من تركيز الأكسجين المستهدف المتدفق عبر النظام ، استهدف ما يقرب من خمسة لترات في الدقيقة من تدفق الغاز. إعادة توجيه تقاطعات T من الخزانات إلى إنتاج الغاز. كما يبدأ الغاز في التدفق من خلال زجاجة المصل، وإيلاء اهتمام وثيق لقياس الضغط، وإذا زاد الضغط بشكل غير متوقع، وإغلاق النظام على الفور.
بعد تشغيل، والأوكسجين من خلال تجنيب زجاجة المصل لمدة دقيقة واحدة في خمسة لترات في الدقيقة الواحدة، وإعدادات تسمح ل10 التبادلات الجوية وضمان الغلاف الجوي الداخلي يصل إلى التركيز المطلوب من الأكسجين 100٪. إزالة إطلاق الغاز، 18 إبرة قياس. بعد السماح للضغط في زجاجة المصل لبناء إلى جو واحد، على الفور إزالة إبرة إخراج الغاز.
احتضان زجاجات المصل في 37 درجة مئوية حاضنة شاكر في 150 تناوب في الدقيقة الواحدة لمدة 3، 24 ساعة فترات. يتم أخذ أليك واتس في كل فاصل زمني 24 ساعة لتحليل المصب ويتم إعادة تدريج العينات في كل مرة. يوضح المثال هنا كيف قد تبدو الثقافة قبل وبعد الحضانة.
تم قياس مستويات الأكسجين ودرجة الحموضة الخارجة على مدار عملية زراعة عينات البلغم التي تم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. مع كل من فترات التجنيب من 12 ساعة و 24 ساعة، تم الحفاظ على تركيزات الأكسجين تقريبا مع مرور الوقت مع انخفاض معتدل في تركيز الأكسجين لوحظ لجميع الشروط الثلاثة. وكانت مستويات الحموضة المقاسة ضمن النطاق الفسيولوجي دون أي تغييرات كبيرة مع مرور الوقت.
وكشفت مقارنة الحمل الميكروبي والتنوع وتكوين المجتمع بين البلغم غير المستزرع والمثقف عن زيادة قدرها 20 ضعفا في الحمل الميكروبي في البلغم المستزرع. وأشارت مقاييس التنوع إلى الحفاظ على تكوين المجتمع المحلي مع الحد الأدنى من الاختلافات العالمية التي أدخلتها عملية الثقافة. تم إجراء تحليل مقارن للأنواع الميكروبية ال 120 في البلغم المستزرع وغير المستزرع من خلال التسلسل الجينومي الفوقي.
وقد تم تحديد 46 نوعا من هذه الأنواع في عينات غير مزرعة ومثقفة على حد سواء. وفي حين تم تحديد 35 منها حصرا في عينات غير مثقفة، تم تحديد 39 منها حصرا في عينات مثقفة. تم إنشاء منحنيات النمو القائمة على ماصة لمسببات الأمراض الرئة CF المشتركة المستزرعة في وسائل الإعلام البلغم الاصطناعي من عزل عينة المريض تحت تركيز الأكسجين العادي 21٪.
لم يحدث أي تغيير مع مرور الوقت في الكثافة البصرية عند 600 نانومتر في ASM فقط التحكم السلبي أشار إلى ثقافة خالية من التلوث. لوحظت أنماط منحنى النمو النموذجية التي تشير إلى أنه يمكن استخدام متوسط ASM لتوليد منحنيات النمو باستخدام الطرق البصرية. يتم استخدام التسلسل الميتاجنومي هنا لوصف تكوين المجتمع الميكروبي.
ويمكن استخدام تقنيات أخرى مثل التسلسل الميتاترانوبتومي لتقييم التعبير الجيني أو المستقلب لتقييم إنتاج المستقلب.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول نظامًا نموذجيًا لدراسة تأثيرات ارتفاع الأكسجين على المجتمعات الميكروبية في المسالك الهوائية في التليف الكيسي. وهو يستخدم وسطًا صناعيًّا للبلغم لتكرار تكوين البلغم وظروف ارتفاع الأكسجين لمحاكاة تأثيرات الأكسجين الإضافي على الميكروبيوم الرئوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- صحة الجهاز التنفسي
- بحوث التليف الكيسي
الخلفية
- غالبًا ما يعاني مرضى التليف الكيسي من تغيرات في الميكروبيوم الرئوي.
- يمكن للأكسجين الإضافي أن يؤثر على المجتمعات الميكروبية في الرئتين.
- تم تصميم الوسط الصناعي للبلغم لتقليد الظروف الفسيولوجية للتليف الكيسي.
- يمكن أن يساعد فهم هذه التفاعلات في توجيه استراتيجيات العلاج.
هدف الدراسة
- تطوير نموذج لدراسة تأثيرات ارتفاع الأكسجين على الميكروبيوم الرئوي.
- استخدام الوسط الصناعي للبلغم لزراعة المجتمعات الميكروبية.
- استكشاف الآثار المترتبة على التليف الكيسي والأمراض الرئوية المزمنة الأخرى.
الطرق المستخدمة
- تحضير الوسط الصناعي للبلغم (ASCM).
- إدخال ظروف أكسجين متفاوتة من خلال الرش.
- تتبيل درجة الحموضة باستخدام عازل mops لتحقيق الظروف المثلى.
- تعقيم الوسط بالترشيح في بيئات خاضعة للرقابة.
النتائج الرئيسية
- نمذجة ناجحة للمجتمعات الميكروبية تحت ظروف ارتفاع الأكسجين.
- برهنة على قابلية الوسط الصناعي للبلغم للتكيف مع أمراض مختلفة.
- تحديد التفاعلات المحتملة بين مستويات الجلوكوز والنمو الميكروبي.
- توفير إطار عمل للبحث المستقبلي حول الميكروبيوم الرئوي.
الاستنتاجات
- يقوم النموذج بشكل فعال بمحاكاة تأثير الأكسجين الإضافي على الميكروبيوم الرئوي.
- يمكن تعديل الوسط الصناعي للبلغم ليكون متوافقًا مع مختلف الظروف الرئوية المزمنة.
- تسهم هذه الدراسة في فهم الديناميات الميكروبية في التليف الكيسي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Modeling the impact of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome addresses a critical gap in understanding how hyperoxic conditions influence microbial community dynamics. This capability enables predictive assessment of therapeutic interventions and supports risk-adjusted decisions in respiratory drug discovery pipelines. The approach enhances translational continuity by providing a physiologically relevant in vitro system for mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community responses to oxygen modulation in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the effects of hyperoxia on pathogen and commensal populations.
- Facilitates functional target validation for interventions aimed at modulating airway microbiota.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized artificial sputum medium for reproducible microbial culture under controlled oxygen conditions.
- Enables quantitative growth curve generation for common cystic fibrosis pathogens using optical density measurements.
- Supports assay readiness for evaluating compound effects on microbial community composition and load.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with clinical airway microbiome profiles through metagenomic sequencing comparisons.
- Maintains translational relevance by preserving community diversity and composition under normoxic and hyperoxic conditions.
- Enables risk-adjusted advancement of microbiome-modulating therapies by modeling real-world supplemental oxygen exposure.
Pipeline & Workflow Integration
This model system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of oxygen effects on airway microbiota, supporting both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on oxygen-driven microbial shifts and their mechanistic implications.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for microbial growth and community analysis.
- Analytics: Provides metagenomic and optical density readouts for robust condition comparisons.
- Translational Research: Bridges in vitro and clinical microbiome data for biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to other chronic lung disease models and metabolic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-targeted interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes microbial culture conditions and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for respiratory portfolio assets by modeling clinically relevant oxygen exposures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiome-modulating candidates and supports cross-program data integration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, metagenomics, and respiratory disease modeling.
- Needs access to controlled gas sparging systems, incubator shakers, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of artificial sputum medium preparation and oxygen modulation protocols.
- Adaptable to model other chronic lung diseases or metabolic comorbidities by modifying medium composition.
- Limitations include the need for careful oxygen and pH monitoring to maintain physiological relevance.
