قياس تدفق الركيزة الميتوكوندريا في الخلايا المتالفة Perfringolysin O-Permeabilized

لأنه يختبر تدفق الركيزة الميتوكوندريا التي يمكن أن تتأثر مع أمراض مختلفة أو العلاجات. على سبيل المثال، اليوم سوف نستخدمها للكشف عن استجابة الخلايا السرطانية لعلاج الميتفورمين. فإنه يتطلب الحد الأدنى من عدد الخلايا في حين وجود تكرارات كافية والسيطرة المناسبة لكل مادة متميزة.

محلل هو للاستخدام البحثي فقط. هذه التقنية يمكن تحديد الأخطاء في التمثيل الغذائي الميتوكوندريا ويمكن استخدامها لتقييم المحاربين المخدرات التي تؤثر على الميتوكوندريا. إثبات الإجراء سيكون كارولينا Vaneckova طالب جامعي وفني البحوث من مختبري.

لبدء البذور A549 الخلايا في كثافة 20،000 الخلايا لكل بئر في الأعمدة، واثنين إلى 11 من حصان البحر XF 96 خلية الثقافة لوحة صغيرة. ترك العمودين الأول والثاني عشر فارغين كالآبار الخلفية. ملء الآبار الفارغة مع حجم متساو من المتوسط ثقافة الخلية، ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمرفق الخلية.

بعد ثلاث إلى أربع ساعات، إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا ثقافة المتوسطة في ويلز. علاج أعمدة المجموعة التجريبية من سبعة إلى 11 مع واحد ميتفورمين ملليمولار ومجموعة التحكم مع حجم متساو من الماء المقطر العقيم، ثم العودة لوحة إلى الحاضنة. لترطيب أجهزة الاستشعار، ماصة 200 ميكرولتر من المياه العقيمة لكل بئر في لوحة المرافق.

ثم أعد خرطوشة المستشعر بعناية أثناء غمر المستشعر في الماء. احتضان خرطوشة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي. قم بتشغيل محلل وحدة التحكم.

بدء تشغيل برنامج التحكم في الأجهزة والحصول على البيانات، وتصميم بروتوكول الفحص كما هو موضح في المخطوطة النصية. في إطار تعريفات المجموعة، قم بإنشاء أربع استراتيجيات للحقن حيث يختلف المنفذ A وفقا للركيزة المحقونة واسم الاستراتيجيات بعد الركائز أو الاختصارات. تعيين أوليغومايسين إلى ميناء B، FCCP إلى ميناء C و Rotenone Antimycin خليط إلى ميناء D.Create وتسمية ثماني مجموعات، تحت خريطة لوحة، تعيين مجموعات إلى ويلز المقابلة.

ثم حفظ البروتوكول كقالب جاهز للاستخدام. اترك مفتاح المحول للسماح لاستقرار درجة الحرارة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تجاهل المياه من لوحة المرافق وإضافة 200 ميكرولتر من calibrant قبل الحارة لكل بئر في لوحة المرافق.

أعد الخرطوشة إلى حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون حتى وقت الفحص. الحفاظ على مصدر للرطوبة داخل الحاضنة وإيقاف أو تقليل سرعة المروحة إلى أدنى حد ممكن، لتجنب التبخر السريع للخلاب. إعداد خمسة ملليلتر من حل العمل من الركائز ومثبطات مع ما قبل تسخينها مرتين محلول المقايسة الميتوكوندريا، 5٪ BSA والمياه العقيمة كما هو موضح في مخطوطة النص.

بعد ذلك، قم بتحميل منافذ الحقن بالركيزة والمثبطات كما هو موضح في المخطوطة الضريبية. للمعايرة تحت علامة التبويب اختبار التشغيل، انقر على تشغيل البدء لبدء الفحص. أدخل خرطوشة الرقابة المحملة وانتظر اكتمال المعايرة.

إعداد 20 ملليلتر من المتوسطة المقايسة، عن طريق خلط مرتين محلول المقايسة الميتوكوندريا، والمياه العقيمة و 5٪ BSA في أنبوب 50 ملليلتر. إضافة اثنين من microliters من 10 ميكرومولار المؤتلف perfringolysin O، لتحقيق تركيز واحد نانومولار. وإعادة تعليق الخليط مع pipetting لطيف، وتجنب اهتزاز ودوامة.

احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدام ماصة متعددة القنوات لغسل الخلايا والآبار فارغة فارغة مرتين، وذلك باستخدام الكالسيوم قبل الدافئة والمغنيسيوم مجانا حل برنامج تلفزيوني. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 180 ميكرولتر من المتوسط المقايسة قبل تسخينها لبيرمابيليز الخلية.

مباشرة بعد permeabilization استبدال لوحة فائدة من خرطوشة الاستشعار معايرة مع لوحة الخلية التي تحتوي على الخلايا permeabilized وبدء القياس. كان لدى مجموعة العلاج معدل أعلى من التنفس المستحث بالنجدة. كانت استجابة خلايا A549 لعلاج الميتفورمين أعلى من Hep G2. بالنسبة للتنفس المستحث بيروفات، أظهرت خلايا A549 زيادة في التعريفي مقارنة بخلايا Hep G2 بين خمس إلى 15 دقيقة.

تم الحصول على نتائج مماثلة للغلوتامات مالات التنفس الناجم عن والتنفس المستحث بالميتويلاكرنيتين. لتحقيق التركيز الصحيح للركيزة ومثبطات. يجب تحميل وحدة التخزين الصحيحة في المنفذ الأيمن.

عندما يتم تحديد تغيير في مسار التمثيل الغذائي لركيزة معينة ، سيكون من الضروري تقييم وظيفة الإنزيمات والنقل المشاركين في هذا المسار.