تحسين فحص حماية الإنزيم لدراسة استوعب المكورات العنقودية والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات

يمكن فحص حماية الإنزيم من دراسة مدى استيعاب ستاف أوريوس وقدرته على البقاء داخل الخلايا الملتصقة ، بالإضافة إلى فعالية مركب مضادات الميكروبات. إن المقايسة المحسنة لحماية الإنزيم تبسط المعالجة التقنية بشكل كبير ، وتمكن من استعادة البكتيريا الداخلية من الخلايا والخلايا الضعيفة التمسك في التعليق. إثبات الإجراء سيكون جوسلين ريغايل، طبيب وطالب دكتوراه من مختبري.

قبل يومين من فحص العدوى، البذور A549 الخلايا الظهارية في كثافة 2.0 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر لكل بئر من لوحة 24 بئر واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في 36 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون٪ 5، حتى تصل إلى التقاء 100٪. في يوم الفحص، قم بإزالة وإزالة وسيط الثقافة المستهلكة من الآبار الثلاثة المخصصة لعد خلايا A549، وإضافة ملليلتر واحد من وسيط العدوى الكامل الذي يحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Hoechst 33342 وميكروغرام واحد لكل ملليلتر من يوديد البروبيديوم. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة، ثم، وذلك باستخدام المجهر الفلوري واسعة المجال، عد عدد الخلايا وحساب صلاحية الخلية.

لإعداد التعليق البكتيري ، والاستغناء عن 25 ملليلتر من المتوسط العدوى كاملة في أنبوب ، وقبل الحرب عليه في 36 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتعديل تعليق المكورات العنقودية والكورس الأوري إلى OD من 0.5 في وسط عدوى كامل باستخدام مقياس كثافة الخلية ، ثم أعد 20 ملليلتر من التعليق البكتيري لتطعيم الخلايا عن طريق تمييع الثقافة في وسط عدوى كامل لتحقيق MOI واحد وفقا لعدد الخلايا لكل بئر. بعد ذلك ، باستخدام لوحة حلزونية أوتوماتيكية ، حدد حمولة المكورات العنقودية الأولى للتعليق البكتيري المخفف لاستخدامها في خطوة تلقيح الخلايا ، واحتضان لوحات أجار لمدة 18 إلى 24 ساعة عند 36 درجة مئوية.

في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات مع عداد مستعمرة لحساب وزارة الداخلية دقيقة لكل سلالة اختبارها. قبل تلقيح الخلايا، لاحظ كل بئر من اللوحة ذات ال 24 بئرا عن طريق المجهر منخفض التكبير لضمان صحة الخلايا ونموها كما هو متوقع، ثم إزالة وتجاهل وسيط زراعة الخلايا المستهلكة من لوحة 24 بئرا وإضافة 500 ميكرولتر من التعليق البكتيري إلى كل بئر يحتوي على خلايا التقاء بنسبة 100٪. احتضان الخلايا لمدة ساعتين في 36 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لقياس البكتيريا داخل الخلايا مع تحسين فحص حماية الإنزيم، وإعداد العازلة تحلل 4x، 2٪تريتون X-100، تريبسين-EDTA، والأسهم ليسوستافين في حلول العمل على النحو المذكور في المخطوطة النصية. المقبل, إعداد 6.25 ملليلتر من المتوسط عدوى كاملة تكملها مع اليسوستافين بإضافة ستة ملليلتر من المتوسطة العدوى كاملة إلى 250 ميكرولتر من محلول عمل اليسوستافين. ثم، إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط العدوى كاملة تكملها مع اليسوستافين في كل بئر وتهيج بلطف لوحة عن طريق تحويل لوحة باليد.

للسماح للليسوستافين بقتل البكتيريا خارج الخلية ، واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في 36 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪، ثم تعطيل الليسوستافين عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من البروتين K في 20 ميكروغرام لكل ملليلتر في كل بئر واحتضان الخلايا لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من العازلة تحلل 4x لتحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية ، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في 36 درجة مئوية. بعد الحضانة ، ماصة الخلية lysate صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان أن يتم التحلل الكامل للخلايا ومتجانسة ، ثم استخدام لوحة حلزونية أوتوماتيكية لتحديد الحمل المكورات العنقودية الذهبية من كل بئر واحتضان لوحات أجار لمدة 18 إلى 24 ساعة في 36 درجة مئوية.

في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات مع عداد مستعمرة لحساب الحمل المكورات العنقودية العنقودية داخل الخلية من كل بئر. يتم تصوير استيعاب نوعين من المكورات العنقودية أوريوس بواسطة الخلايا الظهارية A549 هنا. باستخدام المقايسة حماية الانزيم الذي يتضمن يغسل لإزالة الليسوستافين، وكان متوسط الأحمال داخل الخلايا 4.46 و 0.49 سجل cfu لكل ملليلتر لنوع البرية SF8300 ومتحولة isogenic تفتقر إلى الجينات fnbA و B، على التوالي.

باستخدام محسنة اختبار حماية الانزيم الذي يستخدم البروتين K لinactivate lysostaphin, وكانت الأحمال 4.53 و 0.56 سجل cfu لكل ملليلتر, على التوالي. يصور هنا النشاط داخل الخلايا من فانكومايسين, ريفامبيسين, وليفوفلوكساسين ضد المكورات العنقودية أوريوس قياس باستخدام فحص حماية الانزيم. وكان متوسط الأحمال داخل الخلايا 4.57 سجل cfu لكل ملليلتر للسيطرة، 4.51 لvancomycin، 3.03 للريفامبيسين و 2.91 لليفوفلوكساسين.

غسل مكثفة لإزالة الانزيم تميل إلى فصل الخلايا الأكثر إصابة، والتي يمكن أن تعطي نتائج غير دقيقة ودعم استخدام البروتوكول المحسن. يسهل فحص حماية الإنزيم المحسن دراسة استيعاب Staph aureus مع الجهازي ، ويمكن تكييفه بسهولة على نظام فحص المحتوى العالي الذي يتم استخدامه عن طريق وضع