تسجيل نشاط الشبكة في الدوائر الحساسة للألم في العمود الفقري باستخدام صفائف الأقطاب الدقيقة
February 9th, 2022
يتم تحديد الاستخدام المشترك لتكنولوجيا مصفوفة microelectrode والتحفيز الكيميائي الناجم عن 4-aminopyridine للتحقيق في نشاط مسبب للألم على مستوى الشبكة في القرن الظهري للحبل الشوكي.
يوفر إعداد شريحة العمود الفقري MEA 4-AP الموصوف لك منصة لدراسة اتصال دوائر القرن الظهري وكيفية تفاعل هذه الشبكات أثناء المعالجة الحسية للعمود الفقري. تمكن المنهجية المقدمة من التحقيق في نشاط دائرة القرن الظهري على المستوى الإقليمي العياني للاستبانة. يمكن استخدام هذا المستحضر كأداة فحص سريع لتقييم قدرة المركبات على تعطيل الإشارات في الدوائر الحسية الشوكية.
تساعد هذه الطريقة على سد الفجوة في فهمنا لكيفية تأثير نشاط أنواع معينة من الخلايا والدوائر الدقيقة الصغيرة على مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية لتشكيل مخرجات استجابات سلوك القرن الظهري في نهاية المطاف تجربة الألم. للبدء ، املأ MEA جيدا بمصل الحصان لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة المصل، اشطف MEA جيدا خمس مرات بالماء المقطر حتى يصبح الماء المقطر غير رغوي.
ثم املأ البئر بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. بعد قطع رأس الفأر المخدر ، قم بإزالة الجلد فوق منطقة البطن عن طريق إجراء قطع صغير في الجلد على مستوى الوركين. ثم اسحب الجلد على جانبي القطع بشكل علوي حتى تتم إزالة الجلد بالكامل من أعلى القفص الصدري إلى أعلى الحوض ، سواء من الناحية البطنية أو الظهرية.
بعد وضع الجسم على الجليد ، استخدم نهجا بطنيا لفضح العمود الفقري عن طريق إزالة الأحشاء وقطع الأضلاع أفقيا إلى القص. قم بإزالة القفص الصدري البطني ، وكل من الكتف ، والأطراف السفلية والحوض. انقل العمود الفقري وإعداد الأضلاع إلى حمام تشريح يحتوي على السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي البارد الثلجي.
قم بتثبيت جميع الزوايا الأربع للتحضير عن طريق وضع دبابيس من خلال عضلات أسفل الظهر والأضلاع العلوية المرفقة. قم بإزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة التي تغطي السطح البطني للفقرات مع الرونور وتحديد المنطقة الفقرية فوق التوسيع القطني العجزي ، والذي يقع تقريبا تحت الأجسام الفقرية T12-L2. قم بإزالة ذيلية للجسم الفقري إلى منطقة التوسيع القطني العجزي للوصول إلى الحبل الشوكي الجالس على القناة الفقرية.
باستخدام مقص زنبركي منحني ، قم بقطع عنيقات العمود الفقري بشكل ثنائي أثناء رفع وسحب الجسم الفقري بشكل كبير لفصل الجوانب البطنية والظهرية للفقرات وفضح الحبل الشوكي. بمجرد إزالة الأجسام الفقرية للكشف عن التضخم القطني العجزي ، قم بمسح الجذور المتبقية بعناية التي تثبت الحبل الشوكي بمقص زنبركي حتى يطفو الحبل بحرية. اعزل الحبل الشوكي بجروح في السطح والذيلية فوق وأسفل التوسيع القطني العجزي لجعل المنطقة المستهدفة من الحبل تطفو بحرية.
بالنسبة للشرائح المستعرضة، ارفع الجزء القطني العجزي وضعه بواسطة مسار مرفق على كتلة بوليسترين مقطوعة مسبقا مع قناة ضحلة مقطوعة في المنتصف. ثم ، استخدم لاصق cyanoacrylate لتوصيل الكتلة والحبل بمنصة التقسيم ووضعها في حمام القطع الذي يحتوي على ملاط CSF الاصطناعي من السكروز البارد الثلجي. بمجرد الحصول على شرائح بسمك 300 ميكرومتر ، انقل الشرائح إلى غرفة حضانة واجهة الهواء التي تحتوي على CSF الاصطناعي المؤكسج واسمح للشرائح بالتوازن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
لبدء تسجيل نشاط القرن الظهري، انقل الشريحة من الحاضنة إلى بئر الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام ماصة باستور كبيرة الطرف مملوءة بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي وأضف CSF اصطناعيا إضافيا. استخدم فرشاة طلاء شعر قصيرة ناعمة لوضع الشريحة فوق صفيف تسجيل 60 قطبا. بعد ذلك، ضع رقبة مرجحة فوق الأنسجة لتثبيتها في مكانها وتعزيز الاتصال الجيد مع أقطاب MEA.
ضع MEA في مرحلة رأس التسجيل. تحقق من موضع الأنسجة فوق الأقطاب الكهربائية باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن أكبر عدد ممكن من الأقطاب الكهربائية تحت DH السطحي. تأكد من أن اثنين إلى ستة أقطاب كهربائية على الأقل لا تتصل بالشريحة. بعد توصيل الكاميرا بالجهاز، التقط صورة مرجعية للشريحة المتعلقة ب MEA لاستخدامها أثناء التحليل.
ثم اضغط على بدء DAQ في برنامج التسجيل وتأكد من أن جميع الأقطاب تتلقى إشارة واضحة. بعد ذلك ، قم بتوصيل خطوط مدخل ومخرج التروية ب MEA المملوءة جيدا ب CSF الاصطناعي وقم بتشغيل نظام التروية. تحقق من معدل التدفق وتأكد من أن التدفق الخارجي كاف لمنع تجاوز الفوسات الزائدة.
بعد موازنة الأنسجة لمدة خمس دقائق، سجل بيانات خط الأساس الخام لمدة خمس دقائق. انقل خط مدخل التروية من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي إلى محلول 4-aminopyridine وانتظر لمدة 12 دقيقة حتى يصل النشاط الإيقاعي الناجم عن 4-aminopyridine إلى حالة مستقرة. ثم ، سجل خمس دقائق من النشاط الناجم عن 4-aminopyridine وكن مستعدا للتسجيلات اللاحقة لاختبار الأدوية أو التحقق من استقرار 4-aminopyridine.
بعد كل جلسة تسجيل، اشطف الخطوط باستخدام السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. بعد إزالة MEA من مرحلة الرأس وإزالة الشبكة والأنسجة من MEA جيدا ، اشطف MEA والشبكة باستخدام CSF الاصطناعي وكرر العملية برمتها بشريحة جديدة. افتح برنامج التحليل وقم بتحميل تخطيط التحليل المصنوع مسبقا.
افتح ملف الاهتمام وقم بإلغاء تحديد القطب المرجعي وأي أقطاب كهربائية تعتبر صاخبة بشكل مفرط. قم بتعيين النافذة الزمنية للتحليل. ثم انتقل إلى علامة التبويب عامل تصفية عبر القنوات.
حدد المرجع المعقد والأقطاب الكهربائية المرجعية استنادا إلى الصورة التي تم التقاطها والملاحظات التي تم تدوينها أثناء التجربة واضغط على استكشاف قبل المتابعة. انتقل إلى علامة تبويب عامل تصفية EAP وقم بتطبيق عامل تصفية Butterworth عالي التمرير من الدرجة الثانية لإزالة نشاط LFP. انتقل إلى علامة تبويب عامل تصفية LFP وقم بتطبيق مرشح Butterworth لتمرير النطاق من الدرجة الثانية لإزالة نشاط EAP.
في علامة التبويب كاشف EAP ، تأكد من تحديد العتبة التلقائية ، ووضع علامة في مربعات الحافة الصاعدة والهابطة ، وتعيين الوقت الميت إلى ثلاثة مللي ثانية. لتعيين عتبات إيجابية وسلبية، افحص البيانات عن طريق العودة إلى شاشة محلل البيانات الأولية، وتحريك علامة الوقت، والعودة إلى علامة التبويب كاشف EAP، والضغط على استكشاف. كرر العملية حتى تلتقط عتبة الكشف المحددة EAPs دون التقاط الضوضاء أو النشاط غير الفسيولوجي.
في علامة التبويب كاشف LFP ، تأكد من تحديد العتبة اليدوية ، ووضع علامة على مربعات الحافة الصاعدة والهابطة ، وتعيين الوقت الميت إلى ثلاثة مللي ثانية. قم بتعيين عتبة لقطب واحد ، وبمجرد الرضا ، حدد تطبيق على الكل ثم اضغط على بدء التحليل. ألغى تطبيق الحمام لمضاد قناة الصوديوم المسور الجهد tetrodotoxin كل من نشاط EAP و LFP ، مما يؤكد اعتماد الارتفاع لهذه الإشارات.
تم تمييز استقرار معلمات النشاط المستحثة ب 4-aminopyridine ل EAP أو LFP. كانت جميع خصائص النشاط بالإضافة إلى تزامن النشاط ل LFPs مستقرة بناء على تشابه النشاط الناجم عن 4-aminopyridine في 12 دقيقة بعد تطبيق 4-aminopyridine وبعد 15 دقيقة. تميزت EAPs أو LFPs الخاصة بالميزة بزيادة في عدد الأحداث المتزامنة المكتشفة عبر أقطاب كهربائية متعددة.
عدد الأقطاب الكهربائية المجاورة المرتبطة، وقوة الروابط بين الأقطاب الكهربائية المجاورة وLFPs بعد تحفيز 4-aminopyridine ثم الاستقرار النسبي. اتجاه الشريحة هو اعتبار مهم للاستعدادات في المختبر. حفز 4-أمينوبيريدين نشاطا إيقاعيا مشابها في SDH بغض النظر عن اتجاه الشريحة.
أخيرا ، لإلقاء مزيد من الضوء على أهمية تنشيط 4-aminopyridine لشبكات DH ، تم تطبيق محلول CSF اصطناعي مرتفع للبوتاسيوم وأظهر أنه يثير استجابة DH مماثلة لتحفيز 4-aminopyridine. الخطوات الرئيسية في البروتوكول هي في إعداد الأنسجة ووضع الأقسام، وضمان الأنسجة صحية من خلال تشريح دقيق، ولكن في الوقت المناسب، فضلا عن تحديد المواقع المثلى الدقيقة للأنسجة على MEA سيساعد في الحصول على نتائج جيدة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تحدد هذه الدراسة الاستخدام المشترك لتكنولوجيا مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) والتحفيز الكيميائي المحدث بـ 4-أمينوبيريدين للتحقيق في النشاط الألمي في القرن الظهري للحبل الشوكي. تتيح المنهجية فحص نشاط دوائر القرن الظهري وكيفية تفاعل هذه الشبكات أثناء المعالجة الحسية الشوكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزيولوجيا الكهربية
- الإحساس بالألم
الخلفية
- فهم المعالجة الحسية الشوكية أمر بالغ الأهمية لأبحاث الألم.
- القرن الظهري يحتوي على دوائر محورية للاستجابة للألم.
- تحقيق هذه الدوائر يمكن أن يعزز معرفتنا بآليات الألم.
- توفر مصفوفات الأقطاب الدقيقة تسجيلات عالية الدقة لنشاط الدوائر.
غرض الدراسة
- لتحديد خصائص اتصال ووظيفة القرن الظهري.
- لتقييم تأثير العوامل الدوائية على الدوائر الحسية الشوكية.
- لسد الفجوات المعرفية في الإشارة الألمية على مستوى الشبكة.
الطرق المستخدمة
- استخدمت الدراسة منصة MEA لتسجيل نشاط الدوائر في الشرائح الشوكية.
- تم تحضير شرائح الحبل الشوكي للفأر لعزل ودراسة القرن الظهري.
- تم استخدام 4-أمينوبيريدين لتحفيز النشاط الإيقاعي للتحليل.
- حددت البروتوكولات التفصيلية التحضير الجراحي وقطع الشرائح ومراحل التوازن.
- تم تسهيل تسجيل البيانات من خلال الأقطاب الكهربائية في بئر MEA.
النتائج الرئيسية
- تتيح هذه الوسيلة تسجيل نشاط كهربائي مهم للقرن الظهري.
- أدى تطبيق 4-أمينوبيريدين إلى أنماط إيقاعيّة ثابتة ضرورية للدراسة.
- يمكن للتلاعب الدوائي أن يكشف التأثيرات على مسارات الإشارات.
- تمت ملاحظة تفاعلات الشبكة، مما يسلط الضوء على المعالجة المعقدة للألم في الحبل الشوكي.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة تطبيقًا جديدًا لتكنولوجيا MEA في أبحاث الألم.
- تُمكّن المنهجية المستخدمة من فهم أفضل للدوائر الألمية.
- قد تفيد الرؤى المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية لإدارة الألم.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution network-level recording in spinal nociceptive circuits addresses a critical gap in understanding pain pathway modulation and target engagement. The MEA-based workflow enables rapid, quantitative assessment of compound effects on dorsal horn activity, supporting predictive confidence in early-stage analgesic discovery. This platform enhances translational continuity from mechanistic interrogation to preclinical screening, directly impacting portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of dorsal horn circuit connectivity and functional target validation in pain pathways.
- Supports biological de-risking by linking cellular and network-level responses to candidate modulation.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through quantitative, multi-site neural activity mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated spinal cord slice systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative readouts of network activity across multiple electrodes.
- Enables scalable, rapid screening of antinociceptive compounds for functional disruption of nociceptive signaling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by accommodating tissue from naïve, chronic pain, and genetically modified mice.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of analgesic candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying network-level pharmacodynamic effects.
Pipeline & Workflow Integration
This MEA-based method integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in pain research pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping network responses to chemical and genetic perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated spinal slice systems.
- Analytics: Provides multi-electrode measurements and statistical outputs for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models, supporting biomarker alignment and disease relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing target validation and compound screening across pain research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pain target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales network-level electrophysiological assays for reproducible screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling early functional de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of analgesic candidates based on quantitative network disruption.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spinal cord dissection, slice preparation, and electrophysiological recording.
- Demands access to microelectrode array instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of tissue handling and data analysis protocols.
- Adaptable to various mouse models, including naïve, disease, and genetically modified lines.
- Dependent on tissue health and precise slice placement for optimal data quality.
