Name: إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: اكتشف بروتوكول إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 باستخدام مكونات منقاة بالكامل في بروتيو ليبوسومات محددة. يتيح هذا النظام البسيط دراسة آليات مراقبة جودة البروتين بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

وقد طور MLW جزءا من هذا البروتوكول خلال دراساته بعد الدكتوراه مع الدكتور روبرت كينان في جامعة شيكاغو.
يتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة 1R35GM137904-01 إلى MLW.

تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على نظام قوي لمراقبة جودة البروتين. نظرا للحدود المتأصلة في إخلاص مسارات استهداف بروتين TA ، فإن بروتينات TA غير المعايرة هي مصدر ثابت للإجهاد للميتوكوندريا. أحد المكونات الرئيسية لشبكة البروتيوستازي الميتوكوندريا هو Msp1 ، وهو غشاء راسي AAA + ATPase يزيل بروتينات TA غير المعايرة من OMM. هنا، لقد وصفنا كيفية إعداد البروتيوليبوسومات، وإعادة تشكيل Msp1 ونموذج بروتين TA، وإجراء فحص الاستخراج. استخدمنا هذا المقايسة سابقا لإثبات أن Msp1 تعترف مباشرة ببروتينات TA غير المقيسة بشكل خاطئ وقادرة ...

تعتمد الوظيفة الخلوية المناسبة على عملية تسمى البروتيوستازي ، والتي تضمن أن البروتينات الوظيفية هي في التركيز الصحيح والموقع الخلوي1. الفشل في البروتيوستاسيس يؤدي إلى ضعف وظيفة العضيات وترتبط مع العديد من الأمراض العصبية2,3,4. البروتينات الغشاء تمثل تحديات فريدة من نوعها لشبكة البروتيوستازي كما يجب أن تكون موجهة إلى الغشاء الصحيح مع تجنب التجميع من المجالات transmembrane الكاره للماء (TMDs)5. وبالتالي، تطورت الآلات المتخصصة لحماية TMD الكاره للماء من السيتوسول وتسهيل الاستهداف والإدخال في الغشاء الخلوي المناسب6و7و8و9و10و11و12و13و14و15.
الميتوكوندريا هي محور الأيض للخلية وتشارك في العديد من العمليات الخلوية الأساسية مثل: الفوسفور التأكسدي، وتوليد كتلة الحديد والكبريت، وتنظيم أبوتوبوتيك16،17. تحتوي هذه العضيات التكافلية على غشاءين، يشار إليهما باسم غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) والغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM). أكثر من 99٪ من بروتينات الميتوكوندريا البشرية 1500 مشفرة في الجينوم النووي وتحتاج إلى نقلها عبر واحد أو اثنين من أغشية مختلفة18،19. وبالتالي تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على شبكة بروتيوستاستاس قوية لتصحيح أي أخطاء في استهداف البروتين أو نقله.
يركز مختبرنا على مجموعة فرعية من بروتينات الغشاء الميتوكوندريا تسمى بروتينات الذيل الراسية (TA) ، والتي لها مجال واحد عبر الميمبران في C-terminus20و21و22و23و24. وتشارك بروتينات TA في عدد من العمليات الأساسية، مثل موت الخلايا المبرمج، ونقل الحوييل، ونقل البروتين25. طوبولوجيا فريدة من نوعها من البروتينات TA يتطلب الإدراج بعد الترجمة، والذي يحدث في reticulum endoplasmic (ER) من قبل دخول الموجه من الذيل الراسية (GET) أو مسارات بروتين الغشاء الشبكي الإنتوبلازمي (EMC) أو في OMM من قبل مسار سيئة الخصائص20،26،27،28. الخصائص الفيزيائية الحيوية للMMD ضرورية وكافية لتوجيه بروتينات TA إلى الغشاء الصحيح29. الاعتراف بالخصائص الفيزيائية الحيوية بدلا من عزر تسلسل محدد يحد من إخلاص مسارات الاستهداف5. وبالتالي ، فإن سوء تقدير بروتينات TA هو إجهاد شائع لشبكات البروتيوستاسي. الإجهاد الخلوي، مثل تثبيط مسار GET، يسبب زيادة في سوء حساب البروتين إلى OMM والخلل الوظيفي الميتوكوندريا ما لم تتم إزالة هذه البروتينات على الفور30،31.
وهناك موضوع مشترك في بروتيوستسيس الغشاء هو استخدام AAA + (ATPase Aالمرتبطة الخلوية Activities) البروتينات لإزالة البروتينات القديمة، التالفة، أو مغلوطة من طبقة الدهون1،32،33،34،35،36،37،38 . البروتينات AAA + هي المحركات الجزيئية التي تشكل حلقات سداسية وتخضع لحركات تعتمد على ATP لإعادة تشكيل الركيزة ، وغالبا عن طريق النقل من خلال المسام المحورية الضيقة39،40. على الرغم من أن جهدا كبيرا قد كرس لدراسة استخراج البروتينات الغشاء من قبل AAA + ATPases، وإعادة تشكيل معقدة أو تنطوي على خليط من الدهون والمنظفات41،42، مما يحد من القوة التجريبية لفحص آلية استخراج الركيزة من طبقة ثنائية الدهون.
Msp1 هو AAA + ATPase المحفوظة للغاية الراسية في OMM والبيروكسيسومات التي تلعب دورا حاسما في بروتيوستاسي الغشاء عن طريق إزالة بروتينات TAمغلوطة 43،44،45،46،47. Msp1 كما تبين مؤخرا لتخفيف التوتر استيراد البروتين الميتوكوندريا عن طريق إزالة البروتينات الغشاء التي المماطلة أثناء النقل عبر OMM48. فقدان Msp1 أو الإنسان homolog ATAD1 النتائج في تجزئة الميتوكوندريا، والفشل في الفوسفور التأكسدي، والمضبوطات، وزيادة الإصابة بعد السكتة الدماغية، والموت المبكر31،49،50،51،52،53،54،55،56.
لقد أظهرنا أنه من الممكن إعادة تشكيل بروتينات TA مع Msp1 والكشف عن الاستخراج من طبقة ثنائية الدهون57. يستخدم هذا النظام المبسط بروتينات نقية بالكامل أعيد تشكيلها في ليبوسومات محددة تحاكي OMM (الشكل 1)58،59. يمكن لهذا المستوى من التحكم التجريبي معالجة الأسئلة الميكانيكية التفصيلية لاستخراج الركيزة التي هي مستعصية تجريبيا مع إعادة تشكيل أكثر تعقيدا تنطوي على بروتينات AAA + أخرى. هنا، نقدم بروتوكولات تجريبية تفصل أساليبنا لإعداد الليبوسوم، وإعادة تشكيل بروتين الغشاء، ومقايسة الاستخراج. ونأمل أن تسهل هذه التفاصيل التجريبية إجراء مزيد من الدراسة لعملية البروتيستاسيس الغشائية الأساسية ولكن غير المفهومة جيدا.

<table><tbody><tr><td>Biobeads</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>كبد البقر فوسفاتيديل إينوزيتول</td><td>أفانتي</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>بيض الدجاج فوسفاتيديل الكولين</td><td>أفانتي</td><td>840051C</td><td>PC بيض</td></tr><tr><td>الدجاج فوسفاتيديل إيثانول أمين</td><td>أفانتي</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL حدد كاشف الكشف عن النشاف</td><td>الغربي GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>يدعم الفلتر</td><td>أفانتي</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>قارورة زجاجية</td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>عمود تدور الجلوتاثيون</td><td>ثيرمو فيشر</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضادة للأرانب</td><td>ثيرمو</td><td>فيشر NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>الطارد الصغير</td><td>أفانتي</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>غشاء البولي</td><td>كربونات أفانتي</td><td>610006</td><td>200 نانومتر</td></tr><tr><td>غشاء PVDF</td><td>ثيرمو فيشر</td><td>88518</td><td>45 & مايكرو ؛ M</td></tr><tr><td>Rabbit مضاد لعلم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>اصطناعي 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>Synthetic 1 '، 3'-bis [1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho] -glycerol</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>حقنة</td></tr><tr><td>TOCL ، 1 مل</td><td>حقنة Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>، 1 مل ، محكم</td> <td>الغازأفانتي</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

إعادة تشكيل نشاط استخراج msp1 مع مكونات منقى بالكامل

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

كمركز للفوسفور التأكسدي والتنظيم المبرمج، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في صحة الإنسان. تعتمد وظيفة الميتوكوندريا المناسبة على نظام مراقبة جودة قوي للحفاظ على التوازن البروتيني (داء البروتيستاسيس). وقد تم ربط الانخفاض في البروتيستاسيس الميتوكوندريا للسرطان, الشيخوخة, تنكس الأعصاب, والعديد من الأمراض الأخرى. Msp1 هو AAA + ATPase الراسية في الغشاء الميتوكوندريا الخارجي الذي يحافظ على البروتيوستاسيس عن طريق إزالة البروتينات التي ترتكز على الذيل معكوسة بشكل خاطئ. باستخدام المكونات المنقى المعاد تشكيلها في البروتيوليبوسومات، أظهرنا أن Msp1 ضروري وكافية لاستخراج بروتين نموذجي يرتكز على الذيل من طبقة ثنائية الدهون. لدينا نظام مبسط إعادة تشكيلها يتغلب على العديد من الحواجز التقنية التي أعاقت دراسة مفصلة لاستخراج البروتين الغشاء. هنا، ونحن نقدم أساليب مفصلة لتوليد الليبوسومات، وإعادة تشكيل البروتين الغشاء، واستخراج Msp1 المقايسة.

لتفسير النتائج بشكل صحيح ، يجب النظر إلى الجل الخالي من البقع واللطخة الغربية معا. يضمن الجل الخالي من البقع التحميل المتساوي عبر جميع العينات. عند عرض هلام وصمة عار خالية، والمرافقين (GST-calmodulin وGST-SGTA) سوف تكون مرئية في INPUT (I) وEUTE (E) الممرات. تحقق من أن كثافة هذه النطاقات موحدة عبر جميع عينات INPUT. وبالمثل، تأكد من أن كثافة موحدة عبر عينات ELUTE. وEUTE هو 5x أكثر تركيزا من INPUT وهذا الفرق في كثافة سوف تكون مرئية في المواد الهلامية.
بعد استخدام هلام خالية ...

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لإعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات نقية بالكامل في البروتيوليبوسومات المحددة.

إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

استخدام AAA-ATPases لإزالة البروتينات من طبقة ثنائية الدهون هو موضوع شائع في مراقبة جودة البروتين. ويتطلب الفهم الآلي لهذه العملية الأساسية نظاما أعيد تشكيله. وكانت إعادة التشكيل السابقة مع AAA-ATPases معقدة وغير متجانسة.نظامنا بسيط ومحدد بالكامل. وهذا يسمح لنا للتلاعب في AAA-ATPase Msp1، الركيزة، والبيئة الدهنية. للبدء، إضافة المخزن المؤقت لإعادة التشكيل المعدة مسبقا، وتنقية Msp1 والبروتينات TA والدهون في أنبوب PCR، ثم احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق.خلال الحضانة، وقطع غيض من طرف ماصة P200 إلى حوالي 1/8 من شبر واحد في القطر. المقبل، دوامة الأنبوب الذي يحتوي على BioBeads جيدا للحصول على خليط موحد. ثم، بسرعة إزالة الغطاء واستخدام تلميح ماصة P200 قطع لنقل حجم مناسب من الخرز إلى أنبوب PCR فارغة.بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 10 دقائق لإعادة التشكيل ، باستخدام طرف ماصة غير مقطوع ، قم بإزالة جميع السوائل من BioBeads. ثم، نقل 100 ميكرولتر من إعادة تشكيل في أنبوب مع BioBeads والسماح لها بالتناوب على عجلة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي، تدور الأنبوب في PicoFuge بيليه الخرز، ثم نقل المواد المعاد تشكيلها إلى أنبوب PCR نظيفة والحفاظ على أنبوب على الجليد.لإزالة البروتينات التي فشلت في إعادة تشكيل في الليبوسومات، equilibrate أعمدة تدور الجلوتاثيون مع العازلة استخراج، والذي ينطوي عادة على ثلاث

reconstitution-msp1-extraction-activity-with-fully-purified

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول لتنقية نشطة للغاية Hsp104 ، وهو AAA + hexameric البروتين من الخميرة ، والتي المائي ATP الأزواج على تصنيفها البروتين. هذا المخطط يستغل بناء His6 الموسومة لتنقية تقارب...

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا في المختبر لدراسة الإزالة بوساطة Msp1 لبروتينات TA غير الموضعية المدمجة في الطبقة الدهنية الثنائية للجسيمات الشحمية. يتم إعادة تكوين بروتينات Msp1 و TA بشكل مشترك في الجسيمات الشحمية ، ويتم تأكيد الانتقال المعتمد على ATP لبروتينات TA من خلال تنقية التقارب.

مقايسة استخراج Msp1 لدراسة إزالة بروتينات TA غير الموضعية

الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.

إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

ووصف طريقة لتنقية فعالة من البروتينات الانصهار المزدوج بكتيريا الموسومة والمجمعات الخاصة على تعديل streptavidin (بكتيريا-Tactin) الراتنج تساهميا عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). أسلوب لديها مزايا السرعة، وحسن الانتعاش البروتين الهدف ونقاء عالية، ومتوافق مع تحليل لاحقة من قبل مطياف الكتلة.

خطوة واحدة تنقية البروتينات التوأم بكتيريا الموسومة ومجمعات منها على بكتيريا-Tactin الراتنج عبر ربط مع مكرر (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

تؤدي العديد من البروتينات وظيفتها عند ربطها بأسطح الغشاء. يمكن تصوير ارتباط البروتينات الخارجية على أغشية الأقراص النانوية بشكل غير مباشر عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال. نوضح أن التكديس المميز (رولو) للأقراص النانوية الناجم عن وصمة عار الصوديوم السلبية فوسفوتنجستات يتم منعه عن طريق ارتباط البروتين الخارجي.

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

نحن ينص بروتوكول في المختبر فحوصات التنظيم الذاتي للعقل والأعمال المتعلقة بالألغام على بلير دهن معتمدة في دائرة مفتوحة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف كيفية أرفق المقايسة في الدهن يرتدون ميكروكومبارتمينتس PDMS تحاكي ظروف في فيفو برد فعل الحبس.

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

يتيح الإدخال الانتقالي المشترك في الأقراص النانوية المشكلة مسبقا دراسة بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا في بيئات دهنية محددة دون ملامسة المنظفات. يصف هذا البروتوكول إعداد مكونات النظام الأساسية والمعلمات الحرجة لتحسين كفاءة التعبير وجودة العينة.

الإدخال الانتقالي المشترك لبروتينات الغشاء في الأقراص النانوية سابقة التشكيل

يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.

إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات

تصف هذه المقالة منهجية للإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف ، وهو نوكلياز سام ، في نظام تعبير C41 (DE3) ، متبوعا بتنقية البروتين الموسوم باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. يمكن تكييف هذه البروتوكولات مع البروتينات السامة الأخرى الصعبة.

الإفراط في التعبير عن النويات السامة وتنقيتها من الإشريكية القولونية

توضح هذه الدراسة إجراء إعادة تكوين بروتين الغشاء الحساس للحمض المرتبط ب TWIK قناة K+ 2 (المهمة 2) إلى أقراص نانوية. تم تأكيد نجاح التجميع بواسطة مجهر الإلكترون المجمد أحادي الجسيم، الذي أعطى متوسطات فئات ثنائية الأبعاد محددة جيدا.

تقنية لتثبيت بروتينات الغشاء في الأقراص النانوية

اكتشف بروتوكول إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 باستخدام مكونات منقاة بالكامل في بروتيو ليبوسومات محددة. يتيح هذا النظام البسيط دراسة آليات مراقبة جودة البروتين بكفاءة عالية.

إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل

استكشف المزيد من الفيديوهات