استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases
August 27th, 2021
إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.
عرض Phage لا يساعدنا فقط على التحقيق في الخصائص الملزمة للإنزيمات المهمة سريريا ، ولكن أيضا تطوير المغيرات لتلك الإنزيمات والأمراض المقابلة لها. يمكن استخدام شاشة Phage لتطوير ملفات جديدة لمجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة ، كما أنه أسهل في الأداء من طرق العرض التقليدية الأخرى. هذا الإجراء ينطوي على الكثير من العمل المتكرر، وبالتالي فإن المفتاح هو عدم الطيار الآلي والبقاء مركزة في جميع أنحاء.
ابدأ بتطعيم 30 ملليلتر من مرق التتراسيكلين 2YT مع 200 ميكرولتر من ثقافة البذور. احتضانه لمدة ثلاث ساعات تقريبا في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل. تجاهل حل الطلاء من لوحة في بالوعة.
جففه برفق مع المناشف الورقية. ثم إضافة 200 ميكرولتر من PB العازلة لكل المغلفة جيدا. تجاهل العازلة PB من لوحة وتجفيفه على المناشف الورقية.
إضافة 200 ميكرولتر آخر من العازلة PB إلى كل بئر المغلفة من لوحة. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. إذابة مكتبة phage على الجليد ، ثم تمييعها إلى 100X تنوع المكتبة في PBS.
أضف محلول كلوريد الصوديوم البولي إيثيلين غليكول في خمس حجم المكتبة المخفف واحتضان المحلول على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، طرد مركزي الحل في 11، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant والطرد المركزي لمدة دقيقتين أخريين لسحب أسفل supernatant المتبقية وتركيز بيليه phage.
إعادة إنفاق بلطف بيليه phage في ملليلتر واحد من PBT العازلة لكل بروتين الهدف ليتم تحليلها، وعادة ما تكون أربعة في المجموع. إضافة 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل المغلفة جيدا في لوحة التحكم. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
تجاهل المخزن المؤقت PB من لوحة الهدف في الحوض وتجفيف لوحة على المناشف الورقية. نقل جميع ميكرولتر 100 من مكتبة phage في لوحة التحكم إلى كل بئر المغلفة من لوحة الهدف. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك، قم بإزالة مكتبة phage من اللوحة واغسل الآبار المغلفة أربع مرات مع مخزن PT المؤقت. عكس لوحة والاستفادة على منشفة ورقية لإزالة قطرات الماضي من العازلة. إضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المولر 0.1 إلى كل المغلفة جيدا لe elute phage.
احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تحييد الحموضة بإضافة 12.5 ميكرولتر من الحموضة 11 واحد الضرس تريس هيدروكلوريد إلى كل بئر المغلفة. نقل phage eluted من جميع الآبار الثمانية في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي.
ماصة صعودا وهبوطا أثناء النقل لجعل الحلول متجانسة و أسبيرات جميع السوائل من الآبار. إضافة 10٪ BSA إلى phage eluted لجعل التركيز النهائي 1٪ تخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق في أربع درجات مئوية. هذا هو الناتج الجولة الأولى.
إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار عن طريق تلقيح خمسة ملليلترات من ثقافة بذور التتراسيكلين 2YT مع مستعمرة E.coli معزولة من لوحة أجار. احتضانه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تمييع البروتين المستهدف في الجولتين الثانية وثلاثة أنبوب مع كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني.
خذ نصف محتويات الجولتين الثانية وثلاثة أنابيب ومعطف أربعة آبار لكل بروتين مستهدف في لوحة ملزمة 96 جيدا للجولة القادمة. بعد ذلك، استخدم نصف إخراج الجولة الأولى لتطعيم ثلاثة ملليلترات من خلايا مرحلة منتصف السجل. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.
إضافة M13KO7 المساعد phage إلى تركيز النهائي من 10 مليار PFU لكل ملليلتر. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع 200 RPM اهتزاز المداري. بعد ساعة، نقل كامل ثلاثة ملليلتر من الثقافة إلى 30 ملليلتر من محلول الكاناميسين كاربينسيلين 2YT.
تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تظهر النتائج التمثيلية لاختيار متغير ubiquitin مقابل UBE4B هنا. تم طلب UBVs من أعلى إلى أدنى تردد.
تمثل التسلسلات منطقة كل مكان متنوعة في UBV مع جميع المخلفات العشوائية. يتم قياس التقارب النسبي الملزم للموثقات بالبروتين المستهدف من النوع البري ، البروتين المستهدف المتحول ، وكذلك البروتينات غير المستهدفة من خلال فحوصات مناعية مرتبطة بالإنزيم أو ELISA. تم تطبيع جميع امتصاصات ELISA مقابل 96 متوسط درجات BSA ELISA و 96 متوسط درجات GST ELISA.
يمثل اللون الأخضر الداكن الربط النسبي الأقوى. تم تضمين GST كعنصر تحكم للربط غير المحدد لأن البروتين المستهدف هو علامة GST. يتم عرض نتائج ELISA بيانيا هنا.
يمثل المحور س UBVs ويمثل المحور ص امتصاص تسويتها المقابلة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ألا تتخلص من المحلول الموجود في اللوحة بعد إضافة حمض الهيدروكلوريك. يتم تعليق phages الآن في الحل وتريد الاحتفاظ بها حتى تتمكن من إجراء التحليلات النهائية اللاحقة للتخصيب أو كليهما.
بعد هذا الإجراء، يجب إجراء التسلسل لتحديد ترددات UBV. يمكن إجراء اختبارات ELISAs و IC50 لتحديد الفعالية الملزمة والفعالية المثبطة على التوالي وكذلك للمساعدة في تحديد UBVs التي يجب توصيفها بشكل أكبر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة استخدام تقنية عرض العاثيات لعزل متغيرات جديدة من اليوبيكويتين يمكنها تنظيم إنزيمات E3 الليغازات المتورطة في عملية اليوبيكويتين. يعد اليوبيكويتين تعديلاً مهمًا بعد الترجمة مرتبطًا بالعديد من الأمراض البشرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- هندسة البروتينات
الخلفية
- يعد اليوبيكويتين أساسيًا لتنظيم تحلل البروتين والعمليات الخلوية.
- يرتبط عدم تنظيم اليوبيكويتين بالعديد من الأمراض.
- تعتبر تقنية عرض العاثيات طريقة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتينات.
- تسمح هذه الطريقة بتطوير منظمين محددين للإنزيمات.
هدف الدراسة
- لعزل متغيرات جديدة من اليوبيكويتين باستخدام تقنية عرض العاثيات.
- لفهم كيفية تأثير هذه المتغيرات على نشاط إنزيمات E3 الليغازات.
- لاستكشاف الآثار المترتبة على تنظيم اليوبيكويتين في سياقات المرض.
الطرق المستخدمة
- تلقيح مزارع بكتيرية في مرق 2YT تيتراسايكلين.
- الحضانة عند 37 درجة مئوية مع هزاز مداري.
- استخدام تقنيات عرض العاثيات لاختبارات الارتباط.
- عزل وتوصيف متغيرات اليوبيكويتين.
النتائج الرئيسية
- نجاح في عزل متغيرات جديدة من اليوبيكويتين.
- خصائص الارتباط المثبتة مع إنزيمات E3 الليغازات.
- إمكانية لهذه المتغيرات لتنظيم أنماط اليوبيكويتين.
- أفكار حول دور اليوبيكويتين في آليات المرض.
الاستنتاجات
- تعتبر تقنية عرض العاثيات طريقة فعالة لاكتشاف متغيرات اليوبيكويتين.
- يمكن أن يكون لتنظيم نشاط إنزيمات E3 الليغازات آثار علاجية.
- يلزم إجراء مزيد من البحوث لاستكشاف التطبيقات السريرية لهذه النتائج.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
