Name: تعزيز محتوى الورم من خلال التشريح الكلي للورم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: تعلم تقنية التشريح الكلي لعينات الأنسجة المطمّرة بالبارافين لتحسين محتوى الورم ودقة التحليل الجينومي. تضمن هذه الطريقة استخراج نواتج ورمية نقية لدراسات موثوقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

يتم دعم هذا العمل من قبل موارد عينات الإيدز والسرطان الممولة من المعاهد الوطنية للصحة (<a href="https://www.acsr1.com/">ACSR</a> ، UM1 CA181255-2) في إطار برنامج علوم العينات الحيوية. تم تصوير الفيديو وإجراء تحرير ما بعد الإنتاج بواسطة Mayo Clinic Media Services.

تم جمع جميع العينات واستخدامها وفقا لبروتوكولات IRB المعتمدة في Mayo Clinic (PR16-000507 وPR2207-02).
1. إعداد العينات
<ol><li>قم بتشغيل حمام الماء العائم للأنسجة. اضبط درجة الحرارة على 39 درجة مئوية واسمح للماء بالوصول إلى درجة الحرارة. نقع عصي جمع خشبية في الحمام المائي.</li>
	<li>تحديد واسترداد كتل الأنسجة FFPE ليتم تقسيمها.</li>
	<li>شرائح المجهر قبل التسمية باستخدام علامة دائمة من الدرجة النسيجية يمكنها تحمل غسل المذيبات.</li>
	<li>استخدم ميكروتوم لتقسيم كتل FFPE. قطع ما لا يقل عن 2 أقسام كاملة الوجه بسماكة 4-5 ميكرومتر لكل قسم لكل كتلة (الشكل 1A).</li>
	<li>انقل الشريط المقطوع حديثا لأقسام الأنسجة إلى حمام تعويم الأنسجة الذي تم تسخينه مسبقا لتركيب الشرائح (الشكل 1B ، C). ملاحظة: يساعد الماء الدافئ على "كي" التجاعيد في الأقسام (الشكل 1C).</li>
	<li>عند التعامل مع كل مقطع بالتتابع، استخدم الملقط لكسر مقطع واحد بعيدا عن الشريط (الشكل 1D).</li>
	<li>اجمع القسم الفردي على شريحة مجهر مصنفة مسبقا.<ol>
<li>اغمر شريحة المجهر بزاوية أسفل القسم، مع وضع الشريحة بحيث تلامس حافة قسم الأنسجة الشريحة (الشكل 1E).</li>
		<li>بمجرد ملامسة قسم الأنسجة ، اسحب الشريحة من حمام التعويم ببطء للسماح لقسم الأنسجة بتصويب التدفق ضد الشريحة عند خروجها من الماء (الشكل 1F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بتركيب 1 قسم أنسجة لكل شريحة وكرر حتى يتم جمع جميع الأقسام.</li>
	<li>اترك أقسام الأنسجة المثبتة على الشريحة تجف جيدا في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
</ol>2. المراجعة المرضية
<ol><li>قم بإجراء تلطيخ H&E على قسم أنسجة تمثيلي واحد لكل كتلة9.</li>
	<li>أرسل H&Es الملطخة حديثا للمراجعة المرضية من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة. ملاحظة: أثناء المراجعة ، يحدد أخصائي علم الأمراض ويسجل النسبة المئوية لمحتوى الورم في كل نسيج ويدور حول منطقة الورم على كل شريحة H & E (انظر الشكل 2 والشكل 3 ، الصف 1). يوضح الجدول 1 النسبة المئوية لمحتوى الورم حسب الخلوية المحددة أثناء المراجعة المرضية ل H&Es للعينات من A إلى E الموضحة في الشكل 3 ، الصف 1. تتطلب الأقسام التي تحتوي على <60٪ من محتوى الورم تشريحا كليا7. يعتمد عدد الأقسام اللازمة لاستخراج الحمض النووي على حجم منطقة الورم المحاط بالدائرة. وإذا اقتطعت أقسام غير كافية في القسم 1 من البروتوكول وكان من الممكن إجراء مزيد من الاقتطاعات، فقد يلزم عندئذ خفض أقسام إضافية.</li>
</ol>3. إزالة البارافينات
<ol><li>في غطاء الدخان ، املأ مسبقا طبقين من أطباق تلطيخ الزجاج بمادة الأنسجة غير المخففة D-Limonene أو مذيب قائم على d-Limonene وطبق تلطيخ زجاجي 1 بالإيثانول الجزيئي غير المخفف 200-proof. تحذير: تجنب ملامسة د-ليمونين للجلد والعينين، وتجنب استنشاق البخار أو الضباب، وابتعد عن مصادر الاشتعال. حافظ على الإيثانول بعيدا عن الحرارة والشرر واللهب المكشوف ، وتجنب الانسكاب والتلامس مع الجلد أو العينين ، وتهوية جيدة وتجنب أبخرة التنفس. ملاحظة: املأ الأطباق بما يكفي لغمر الشرائح المثبتة على الأرفف (الشكل 4A) ؛ مطلوب 250 مل لملء أطباق تلطيخ 20 شريحة المعروضة. استبدل غسل d-Limonene والإيثانول بعد كل 40 منزلقة. D-Limonene (C 10 H16) هو بديل ، فعال بالمثل ، وعامل إزالة الشمع أقل سمية للزيلين الذي أصبح أكثر شيوعا في المنهجيات النسيجية وينتج عنه نوعية جيدة من الحمض النووي بعد استخراج10،11،12،13،14. على الرغم من أنه يمكن تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام بدائل أكثر ملاءمة للبيولوجيا15 ، إلا أن آثارها ، إن وجدت ، على جودة الحمض النووي المستخرج لا تزال بحاجة إلى تحديد.</li>
	<li>قم بتركيب الشرائح المثبتة على أنسجة FFPE غير الملطخة في رفوف شرائح Coplin الزجاجية (الشكل 4A ، داخلي).</li>
	<li>غمر الشرائح المثبتة في غسل d-Limonene 1 لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية. ملاحظة: لتقليل الترحيل بين الغسيلات، عند إزالة رف الشرائح من الغسيل، اسمح للحامل بالتصريف لفترة وجيزة قبل وضع الجزء السفلي من الحامل برفق على المناديل الورقية لإزالة الغسيل الزائد.</li>
	<li>غمر الشرائح المثبتة في غسل D-Limonene غير المخفف 2 لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية. قم بإزالة الرف وتصريفه وربته مرة أخرى.</li>
	<li>غمر الشرائح المثبتة في غسل الإيثانول لمدة 2 دقيقة ؛ حراج بلطف لأول 20 ثانية. قم بإزالة الرف وضعه على نسيج ماص لتصريفه. اترك الشرائح لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 2 ساعة.</li>
</ol>3. التشريح الكلي
<ol><li>على مقاعد البدلاء ، املأ وعاء زجاجي كوبلن مسبقا ب 50 مل من الجلسرين بنسبة 3٪ في الماء الخالي من DNase / RNase ملاحظة: استبدل غسل الجلسرين بعد كل 40 منزلقة.</li>
	<li>التسمية المسبقة والتعبئة المسبقة 1.5 مل microtubes مع 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم الأنسجة لكل microtube. ملاحظة: استخدمت عمليات استخراج الأحماض النووية التي أجريت بعد التشريح الكلي مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي FFPE (جدول المواد). وبالتالي ، فإن المخزن المؤقت لهضم الأنسجة المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 ميكرولتر من Proteinase K و 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت PKD.</li>
	<li>تتبع العلامات المرضية على H & E على الجزء الخلفي من شرائح الأنسجة deparaffinized. ملاحظة: بالمقارنة مع الأنسجة غير المنزوعة البارافين (الشكل 3 ، الصف 2 والشكل 4 ب) ، تكون الأنسجة المنزوعة البارافين بيضاء ومرئية للغاية (الشكل 3 والصف 3 والشكل 4 ج). هذه الرؤية المتزايدة وإمكانية التمييز لميزات الأنسجة المنزوعة البارافينات هي التي تسمح بالتشريح الكلي. ضع H & E وجها لأسفل على المقعد وضع الجزء الأمامي من الشريحة المنزوعة البارافينية على الجزء الخلفي من أخصائي علم الأمراض المطابق الذي تمت مراجعته H & E (الشكل 4D). قم بمحاذاة الأنسجة المنزوعة البارافين مع أنسجة H&E (الشكل 4E). يعد تتبع علامات أخصائي علم الأمراض خطوة حاسمة في عملية التشريح الكلي ، ويجب توخي الحذر لإعادة إنتاج هذه العلامات بأكبر قدر ممكن من الدقة. يمكن أن يكون هذا تحديا خاصا للأنسجة الصغيرة أو المنفصلة مثل العينات B و D و E (الشكل 3 والشكل 4E والشكل 4E المضمن i). للمساعدة في التتبع ، يجب على المرء استخدام علامة دقيقة حبرية أو علامة متناهية الصغر (الشكل 4E ، الجزء الثاني الداخلي) لتتبع العلامات التي رسمها أخصائي علم الأمراض. قد تكون مناديل الإيثانول مفيدة لإزالة الأخطاء والسماح بالتتبع إذا لزم الأمر.</li>
	<li>أدر الأنسجة الانزلاقية المنزوعة البارافينية المحددة الآن وجها لوجه وتتبع خط العلامة بزاوية شفرة حلاقة نظيفة لقطع حواف منطقة الورم مسبقا.</li>
	<li>التعامل مع كل شريحة بالتتابع ، اغمس الشرائح المنزوعة البارافين في محلول الجلسرين بنسبة 3٪. تأكد من غمر الأنسجة بالكامل قبل إزالة الشريحة ببطء (الشكل 4F). ملاحظة: الغرض من انخفاض الجلسرين هو تثبيط الأنسجة للمساعدة في جمع الأنسجة ولكن أيضا للحد من تراكم الشحنة الساكنة التي يمكن أن تسبب تنافرا بين الأنسجة والأنبوب الدقيق البلاستيكي الذي يجب وضع الأنسجة التي تم جمعها فيه.</li>
	<li>امسح الجزء الخلفي من الشريحة برفق بمنديل لإزالة محلول الجلسرين الزائد ، وضع الشريحة على المقعد ، ومسح الوجه الجانبي لأسفل. اترك الأنسجة لتجف لفترة وجيزة لمدة 1-2 دقيقة. ملاحظة: يمكن أن يؤثر ترحيل الجلسرين الزائد في عملية الاستخراج سلبا على إنتاجية وجودة عمليات استخراج الأحماض النووية. يجب أن تكون الأنسجة رطبة قليلا ولكنها ليست رطبة بشكل واضح عند جمعها.</li>
	<li>اعتمادا على المكان الذي تقع فيه منطقة اهتمام الورم على الشريحة، استخدم الحافة المسطحة لشفرة الحلاقة إما (أ) لجمع أنسجة الورم مباشرة، باستخدام الحلاقة لكشط / جمع الأنسجة ذات الأهمية من الشريحة، أو (ب) إزالة الأنسجة غير السرطانية والتخلص منها أولا قبل جمع أنسجة الورم ذات الأهمية (الشكل 3). ملاحظة: تميل الأنسجة المجمعة إلى التجمع أو اللف في أسفل الشفرة (الشكل 4G)</li>
	<li>استخدم عصا خشبية لإزالة الأنسجة المجمعة من الشفرة (الشكل 4H والجزء الداخلي) ونقلها إلى الأنبوب الدقيق المناسب المسمى مسبقا والمملوء مسبقا (الشكل 4I). ملاحظة: يعمل المخزن المؤقت للهضم على "سحب" الأنسجة من الالتقاط الخشبي إلى السائل.</li>
	<li>انتقل إلى استخراج الحمض النووي. ملاحظة: تم الانتهاء من استخراج الأحماض النووية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي FFPE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتم تحديد كمية الأحماض النووية الناتجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. تم تشغيل الحمض النووي الريبي الناتج على اختبار DLBCL90 القائم على التنميط الرقمي للتعبير الجيني16.</li>
</ol>

<ol><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
<li>Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lymphoma+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).</li>
<li>Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+next+generation+sequencing+in+oncology%3A+A+guide+for+oncologists%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).</li>
<li>Haile, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high+throughput+nucleic+acid+purification+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples+for+next+generation+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis.</a> PLoS One. 12 (6), 0178706(2017).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+accuracy+of+whole-exome+sequencing+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples.</a> PLoS One. 10 (12), 0144162(2015).</li>
<li>Holley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+clonal+profiling+of+formalin+fixed+paraffin+embedded+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples.</a> PLoS One. 7 (11), 50586(2012).</li>
<li>Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers">https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers</a> (2021).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cold+into+hot%3A+Firing+up+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment.</a> Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+and+risk+assessment+of+d-Limonene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health+Part+B%3A+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).</li>
<li>Foti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+contact+dermatitis+to+a+limonene-based+solvent+in+a+histopathology+technician%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician.</a> Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).</li>
<li>Meuse, C. W., Barker, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+infrared+spectroscopy+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+specimens%3A+paraffin+wax+removal+with+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).</li>
<li>Schmeller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+out+the+frame+conditions+for+feasible+use+of+FFPE+derived+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+-+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA.</a> Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).</li>
<li>Prema, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofriendly+substitutes+for+xylene+in+deparaffinization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).</li>
<li>Ennishi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-hit+gene+expression+signature+defines+a+distinct+subgroup+of+germinal+center+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).</li>
<li>Alizadeh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+identified+by+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling.</a> Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).</li>
<li>Rosenwald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+molecular+profiling+to+predict+survival+after+chemotherapy+for+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+B-cell+lymphoma+with+MYC+and+BCL2+and%2For+BCL6+rearrangements+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology.</a> Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+cell-of-origin+subtypes+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+using+gene+expression+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).</li>
<li>Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+complexity+and+heterogeneity+of+pancreatic+tumor%3A+3D+in+vitro+to+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).</li>
<li>Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).</li>
<li>Geiersbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+guided+microdissection+aids+somatic+mutation+detection+in+difficult+to+dissect+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors.</a> Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).</li>
<li>de Bruin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrodissection+versus+microdissection+of+rectal+carcinoma%3A+minor+influence+of+stroma+cells+to+tumor+cell+gene+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles.</a> BMC Genomics. 6, 142(2005).</li>
<li>Ramsower, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+validation+of+the+MCL35+assay+for+molecular+risk+stratification+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematopathology%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma.</a> Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).</li>
<li>Maguire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+DNA+repair+and+genomic+stability+identify+a+novel+HIV-related+diffuse+large+B-cell+lymphoma+signature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature.</a> International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).</li>
<li>Rosenwald, A., Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).</li>
<li>Wright, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+classification+tool+for+genetic+subtypes+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications.</a> Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).</li>
<li>Hilton, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-hit+signature+identifies+double-hit+diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+genetic+events+cryptic+to+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH.</a> Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

غالبا ما تكون أنسجة FFPE عبارة عن مخاليط غير متجانسة من أنسجة الورم والأنسجة غير الورمية. أصبحت الاختبارات الجينومية عالية الحساسية منتشرة بشكل متزايد في كل من الإعدادات السريرية والبحثية ولكن يمكن الخلط بينها وبين وجود أنسجة غير ورمية ملوثة. في الواقع ، يوصى في كثير من الأحيان بمحتوى الحد الأدنى من الورم بنسبة 60٪ للدراسات الجينومية. يمكن تحديد النسبة المئوية للورم من خلال منطقة الأنسجة التي تشغلها مادة الورم أو من خلال نسبة الخلايا السرطانية داخل الأنسجة. على الرغم من أن الورم حسب المنطقة هو مقياس شائع الاستخدام لنقاء الورم ، إلا أنه لا يصور دائما وصفا دقيقا للأنسجة. فكر في منسجتين ، كلاهما يحتوي على 1000 خلية ، منها 500 خلية سرطانية. في الأنسجة A ، تكون الخلايا غير السرطانية البالغ عددها 500 خلية لحمية ذات أحجام مماثلة لتلك الموجودة في الخلية السرطانية. في هذا النسيج ، يمكن اعتبار النسبة المئوية للورم 50٪ من خلال كل من الخلوية والمساحة. في الأنسجة B ، 500 خلية غير سرطانية هي خلايا دهنية ذات أحجام تبلغ 4 أضعاف حجم الخلية السرطانية. في هذا النسيج ، لا تزال النسبة المئوية للورم 50٪ حسب الخلوية ولكن 20٪ حسب المنطقة. يتكون النسيج الثالث ، النسيج C ، من 500 خلية سرطانية بالإضافة إلى 400 خلية دهنية و 800 خلية لحمية ذات أحجام 4x و 0.5x من الخلايا السرطانية ، على التوالي. بالنظر إلى أن 100 خلية دهنية تساوي حجم 800 خلية لحمية ، فإن النسبة المئوية لورم الأنسجة C هي 29٪ حسب الخلوية (500/1700) ولكن لا تزال 20٪ حسب المساحة. يتكون النسيج D أيضا من الخلايا السرطانية والدهنية واللحمية بنسب حجم 1x و 4x و 0.1x. ومع ذلك ، فإن عدد الخلايا هو 400 و 10 و 720 ، على التوالي. وبالتالي ، فإن النسبة المئوية لورم الأنسجة D هي 35٪ حسب الخلوية (400/1130) ولكن 78٪ حسب المنطقة. هذه الأمثلة مفرطة في التبسيط ولا تعكس تركيبات الأنسجة في العالم الحقيقي ولكنها تنقل بوضوح أهمية تكوين الأنسجة والفرق بين محتوى الورم حسب المنطقة والخلوية. الأهم من ذلك ، عندما يتعلق الأمر بإثراء محتوى الورم لاستخراج الحمض النووي في مجرى النهر ، فإن خلية الورم هي السمة الأكثر أهمية بسبب الإمكانات المربكة المتزايدة لاستخراج المواد الجينومية من الخلايا غير السرطانية أكثر من الخلايا السرطانية. هذا لا يؤكد فقط على الحاجة إلى تقييم محتوى الورم في الأنسجة من حيث النسبة المئوية للخلايا ولكن أيضا الحاجة إلى استئصال الأنسجة غير المرغوب فيها من أجل تقليل أي آثار سلبية محتملة للأنسجة غير الورمية. هناك العديد من الطرق المتاحة لإثراء الأنسجة ، وأهمها التشريح الكلي والتشريح الدقيق.
التشريح الكلي ، الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول ، سريعة نسبيا وبسيطة ولا تتطلب معدات مكلفة أو متخصصة. على الرغم من أن التشريح الكلي يمكن أن يحسن بشكل كبير محتوى الورم ، فمن المهم أن نفهم أنه لا يزيل تماما المواد غير الورم. الغرض من التشريح الكلي هو إثراء الأنسجة ذات الأهمية بما فيه الكفاية من خلال استبعاد الأنسجة غير المرغوب فيها من أجل تقليل "الضوضاء" الناشئة عن الأنسجة غير المرغوب فيها ، والتي بدورها يمكن أن تعزز إشارة الاهتمام من الأنسجة ذات الاهتمام. وبالتالي ، فإن إثراء الورم بوساطة التشريح الكلي هو وسيلة لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء من أجل اكتشاف العلامات ذات الأهمية بشكل أفضل ، وخاصة العلامات الجزيئية الخاصة بالورم ذات الوفرة المنخفضة أو التعبير الضعيف. ومع ذلك ، فإن التشريح الكلي له قيود بسبب نقص الدقة التي توفرها الأدوات الخشنة مثل شفرات الحلاقة وهو عرضة لمشكلات الدقة الناجمة عن سمك خط علامة أخصائي علم الأمراض ، بالإضافة إلى الأخطاء المحتملة عند تتبع ترسيم حدود H & E الخاصة بأخصائيي علم الأمراض. كما هو موضح أعلاه ، لا يمكن تحقيق نقاء الورم بنسبة 100٪ بسبب وجود عناصر لحمية متأصلة ومسببة للورم (أي النسيج الضام ، والخلايا الليفية اللحمية ، والأوعية الدموية ، والخلايا الليمفاوية التفاعلية الحميدة ، والبلاعم) المضمنة داخل الورم نفسه. والواقع أن العديد من الأورام الخبيثة الغازية أو الارتشاحية المنتشرة تحفز استجابة قوية للحماة اللدائن اللدائنية اللحمية، مما يؤدي إلى مجموعات من الخلايا السرطانية التي تختلط ارتباطا وثيقا بالخلايا الليفية اللحمية وغيرها من أنواع الخلايا غير الورمية؛ حيث الأورام المرتبطة بهذا النمط من التفاعل اللحمي ، مثل أنسجة سرطان البنكرياس21 ، قد تستفيد أكثر من التشريح المجهري الموجه رقميا بدلا من التشريح الكلي اليدوي. 
يتم إجراء التشريح المجهري اليدوي تحت المجهر للمساعدة في تحديد وتشريح وعزل خلايا أو مجموعات معينة من الأنسجة باستخدام إبرة أو مشرط وله ميزة زيادة الدقة على التشريح الكلي22. ومع ذلك ، فإن التشريح المجهري اليدوي هو عملية شاقة تفتقر إلى الدقة اللازمة للأنسجة المعقدة ذات محتويات الورم المنخفضة أو الميزات المعقدة التي لا تتوافق مع التشريح اليدوي. يمكن تشريح هذه الأنسجة باستخدام طرق آلية عالية الدقة مثل التشريح المجهري لالتقاط الليزر. في الواقع ، ثبت أن التشريح المجهري الموجه رقميا ينتج عنه نسبة مئوية أعلى من محتويات الورم مقارنة بالتشريح الكلي اليدوي في أنسجة سرطان البنكرياس23. ومع ذلك ، فإن عيوب هذه الأساليب الآلية عالية الدقة ، مثل الحاجة إلى معدات متخصصة ومكلفة وأفراد مدربين تدريبا عاليا ، أعاقت دمجها في سير العمل. وجدت دراسة أجراها دي بروين وآخرون قارنت آثار التشريح الكلي والتشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) على تنميط التعبير الجيني أن عينات LCM لديها إنتاجية RNA إجمالية منخفضة (متوسط 30 نانوغرام) وتتطلب جولتين من تضخيم mRNA من أجل تلبية عتبة مدخلات إعداد مكتبة cDNA24. وجد المؤلفون أن ملامح التعبير الجيني LCM الناتجة تأثرت بجولات تضخيم الحمض النووي الريبوزي المرسال أكثر من تأثرت الملامح المجهرية بالمساهمات اللحمية غير السرطانية وخلصوا إلى أنه يمكن استخدام التشريح الكلي بشكل كاف لتوليد بيانات تعبير جيني موثوقة24. 
ميزة كبيرة من التنميط التعبير الجيني الرقمي NanoString ، وخاصة عند العمل مع الحمض النووي الريبي المشتق من FFPE المتدهور للغاية ، هو أنه لا يتطلب عمليات تعتمد على الأنزيم مثل تضخيم الحمض النووي الريبي أو إعداد مكتبات cDNA. ومع ذلك ، عادة ما يتم تحسين الفحوصات للمدخلات بين 50-300 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي25,26 ، والتي ، بناء على نتائج دي بروين وآخرون 24 ، قد لا تكون متوافقة مع الأنسجة المجهرية دون زيادة مدخلات الأنسجة ؛ طلب غير موات في عصر يتم فيه جمع عينات الأنسجة بشكل متزايد على شكل خزعات صغيرة بدلا من الاستئصال الجراحي. تراوحت مدخلات الحمض النووي الريبي المستخدمة في فحص DLBCL90 من 68.5 إلى 300 نانوغرام لكل من الأنسجة المجهرية وغير التشريحية. أظهرت النتائج أن التشريح الكلي أدى إلى تغييرات في النداء في 60٪ من العينات التي تم فحصها وأن هذه التغييرات لوحظت بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينات المجهرية التشريحية. ومع ذلك ، فإن احتمال COO لإدخال الحمض النووي الريبي المنخفض قد تجاوز عتبة استدعاء احتمال COO GCB / UNC ، حيث تكون العتبات من 0 إلى <0.1 ل GCB ، و 0.1-0.9 ل UNC ، و >0.9 إلى 1.0 لمكالمات ABC20. الأنواع الفرعية الرئيسية ل DLBCL COO هي GCB و ABC ، والتي تشكل 41٪ و 44٪ من جميع حالات DLBCL ، حيث تمثل UNC مجموعة وسيطة من الاثنين و ABC هي الأكثر عدوانية20,27. وهكذا، في حين أن تغيير استدعاء مدير العمليات عند التشريح الكلي للعينة C لم يتسبب في تغيير صريح في النوع الفرعي ل COO من GCB إلى ABC، فإن التغيير من GCB إلى UNC قد يشير إلى تحول نحو مرض أكثر عدوانية. وعلاوة على ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن النوع الفرعي للأمم المتحدة ليس مجرد نوع فرعي وسيط وأنه قد يمتلك سمات قابلة للاستغلال العلاجي خاصة بنوع فرعيمحدد 28. وبالمثل ، لم يتسبب التشريح الكلي للعينتين A و E في تغييرات صريحة في مكالمات DHITsig من DH سلبي إلى DH إيجابي ، أو العكس بالعكس. ومع ذلك، فإن تحركات عينة GCB (العينة A) من NEG إلى UNCLASS وعينة ABC (العينة E) من UNCLASS إلى NEG عند التشريح الكلي مناسبة بيولوجيا حيث تفيد التقارير بأن عمليات النقل المزدوجة التي تنطوي على BCL2 هي ظاهرة GCB حصرا19. على الرغم من أن عمليات النقل يتم اكتشافها تقليديا وفي كل مكان بواسطة FISH في الإعدادات السريرية ، إلا أن هناك زخما متزايدا لتحديد طريقة بديلة أقل مشاركة وتستغرق وقتا طويلا للكشف عنها. يعد فحص DLBCL90 أداة مهمة تلبي هذه الحاجة ، حيث يتم تعزيز الأساس المنطقي لاستخدامه من خلال اكتشاف أن هذا الفحص قادر على اكتشاف عمليات النقل المشفرة إلى تحقيقات FISH المستخدمة في التشخيص السريري29.
يحدد بروتوكول التشريح الكلي الموصوف أعلاه طريقة بسيطة تمكن الباحثين من زيادة محتوى الورم في عينات الأنسجة التي عادة ما تكون أقل من عتبات معايير إدراج الدراسة الشائعة الاستخدام. إن تضمين التشريح الكلي في سير عمل الدراسة يمكن الباحثين من إنقاذ الأنسجة الكثيفة بالورم بشكل سيئ من استبعاد الدراسة عن طريق زيادة محتوى الورم الخاص بها. وهذا بدوره يسمح بزيادة الثقة في أن الحمض النووي الريبي الناتج والحمض النووي يمثل الورم قيد التحقيق الجينومي. على الرغم من وجود طرق أخرى أكثر دقة لتشريح الأنسجة ، إلا أنه بالنسبة للأورام التي تنمو بطريقة أكثر توسعا أو غير ارتشاحية أو تشبه الورقة أو صلبة ، فمن المحتمل أن يكون التشريح الكلي كافيا. تسلط النتائج المعروضة هنا الضوء على أهمية نقاء الورم في الفحوصات الجينومية والتشريح الكلي كأداة موثوقة لتحقيق ذلك.

تمثل الأنسجة المدمجة في البارافين (FFPE) الثابتة بالفورمالين ، والتي تم جمعها كجزء من عملية التشخيص السريري الطبيعية والاحتفاظ بها في مستودعات الأنسجة السريرية ، موردا هائلا للبحوث البشرية ، بما في ذلك أبحاث السرطان1. مع تعمق فهمنا للأمراض البشرية ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الأمراض ، التي كان يعتقد سابقا أنها كيانات فردية تستند إلى الخصائص المورفولوجية والمناعية ، تتكون في الواقع من أنواع فرعية جزيئية متميزة تتطلب اختبارات النمط الفرعي الجزيئي. ونتيجة لذلك، أصبحت المقايسات الجينومية عالية الحساسية القادرة على تمييز هذه الأنواع الفرعية ذات أهمية متزايدة2. على الرغم من أن أنسجة FFPE تشتهر بأنها غير متوافقة بشكل جيد مع التقنيات الجينومية بسبب المشكلات المتعلقة بالتثبيت ، مع تطور التكنولوجيا والبروتوكولات ، إلا أن هذه التقنيات أصبحت متوافقة بشكل متزايد مع تنسيق الأنسجة المنتشر سريريافي كل مكان 3,4,5. ومع ذلك ، غالبا ما تكون أنسجة FFPE عبارة عن خليط من مواد الأنسجة السرطانية وغير السرطانية ، حيث يكون وجود مواد غير ورمية غير مرغوب فيه في كثير من الأحيان ويمكن ، إذا كان موجودا بنسبة عالية ، أن يقوض ويؤثر بشكل كبير على نتائج التحليلات الجينومية6. في الواقع ، يتم استخدام الحد الأدنى من محتوى الورم بنسبة 60٪ في مثل هذه التحليلات ، حيث يمكن استبعاد الأنسجة التي لا تصل إلى هذه العتبة ، على الرغم من استيفاء معايير الدراسة7. يمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة في حالات الأمراض النادرة ، حيث تكون أنسجة المرضى ثمينة ويصعب جمعها بأعداد كبيرة.
التشريح الكلي هو طريقة تقلل من آثار انخفاض محتوى الورم عن طريق تقليل كمية الأنسجة الطبيعية3. يمكن أن تؤدي إزالة هذه المواد المربكة غير السرطانية قبل استخراج الحمض النووي إلى زيادة كبيرة في محتوى النسبة المئوية للورم وبالتالي نقاء الورم للأحماض النووية المستخرجة. يعتمد استئصال الأنسجة بشكل حاسم على المراجعة المرضية للخبراء ، حيث يتم تحديد منطقة الورم ووضعها في دائرة على قسم الأنسجة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) الذي تم إنشاؤه حديثا من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة8. ثم يتم استخدام H & E الدائري لتوجيه إزالة وجمع الأنسجة غير المرغوب فيها والمستهدفة ، على التوالي. يصف هذا البروتوكول خطوات التشريح الكلي من المراجعة المرضية من خلال حصاد الأنسجة كما تم إجراؤه في المختبر الأساسي التقني لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) في Mayo Clinic.

<table><tbody><tr><td>200 إثبات للإيثانول</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA / RNA FFPE KIT</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>DNA / RNA FFPE مجموعة</td></tr> أدوات <tr><td>استخراج Coplin</td><td>مجسات مختلفة</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>DLBCL90</td><td>NanoString</td><td>مختلف</td><td>التنميط الرقمي للتعبير الجيني القائم على DLBCL90 الفحص</td></tr><tr><td>d-Limonene</td><td>VWR</td><td>89376-092</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>مختلف</td><td>×</td><td></td></tr><tr><td>شرائح زجاجية</td><td>ميكروسكوب FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>مجموعات رئيسية</td><td>NanoString</td><td>مختلفة</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td> مقياس الطيف الضوئي <td>ND-ONE-W</td><td>لتأهيل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين</td></tr><tr><td>nCounter</td><td>NanoString</td><td>x</td><td>منصة توصيف التعبير الجيني الرقمي المستخدمة لتشغيل علامة DLBCL90</td></tr><tr><td>الدائم</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>72109-12</td><td></td></tr><tr><td>موزع شفرات الحلاقة</td><td>Electrib Microscope</td><td>Sciences 71985-10</td><td></td></tr><tr><td>شفرات الحلاقة</td><td>مجهر كهربائي علوم</td><td>71985-23</td><td></td></tr><tr><td>عازلة هضم الأنسجة</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>ماء عالي النقاء</td><td>VWR</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr>مثلث<td>حمام</td><td>مائي العلوم الطبية الحيوية</td><td>TFB-120</td><td></td></tr><tr><td>عصا خشبية</td><td>FisherBrand</td><td>22363158</td><td></td></tr></tbody></table>

تعزيز محتوى الورم من خلال التشريح الكلي للورم

Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection

إن وجود أنسجة ملوثة غير ورمية في الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE) يمكن أن يقوض بشكل كبير الدراسات الجينومية. في ما يلي نصف التشريح الكبير، وهي طريقة مصممة لزيادة النسبة المئوية لمحتوى الورم في عينة الأنسجة عن طريق إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها والقضاء عليها قبل إجراء عمليات استخراج الحمض النووي في المصب. تم تقسيم كتل الأنسجة FFPE لإنتاج 4-5 ميكرومتر من أقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح. تم تقديم قسم تمثيلي لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتمت مراجعته لاحقا من قبل أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة. خلال المراجعة ، حدد أخصائي علم الأمراض وميز مناطق أنسجة الورم في H & E. بمجرد الانتهاء ، تم استخدام H & E المحدد لتوجيه استئصال الأقسام التسلسلية غير الملطخة من نفس كتلة الأنسجة. لإثبات آثار التشريح الكلي، تم تشغيل الحمض النووي الريبي المستخرج من الأورام اللمفاوية الكبيرة المنتشرة ذات الخلايا البائية الكبيرة المنتشرة (DLBCL) على فحص تعبير جيني رقمي قادر على تحديد النوع الفرعي DLBCL وحالة نقل BCL2. أظهرت النتائج أن التشريح الكلي غير النوع الفرعي أو مكالمات حالة نقل BCL2 في 60٪ من العينات التي تم فحصها. في الختام ، يعد التشريح الكلي طريقة بسيطة وفعالة لإجراء إثراء الورم قبل استخراج الحمض النووي ، والذي يمكن بعد ذلك استخدام منتجه بثقة في الدراسات الجينومية النهائية.

يقدم هذا البروتوكول طريقة لزيادة نسبة محتوى الورم في عينات الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين.

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we ...

غالبا ما تكون الأنسجة المدمجة في البارافين الثابتة بالفورمالين أو FFPE عبارة عن خليط من المواد السرطانية وغير السرطانية ، حيث يكون وجود مواد غير ورمية في كثير من الأحيان غير مرغوب فيه ويمكن ، إذا كان موجودا بنسبة عالية ، أن يؤثر بشكل كبير على نتائج التحليل الجينومي ، وبالتالي فإن الميزة الرئيسية للتشريح الكلي مقارنة بالعمل مع الأنسجة غير المقطوعة هي أنه يمكن جمع أقسام الأنسجة المستقطعة المنزوعة البارافين الناتجة عن ذلك لاستخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك بثقة في التحليل الجينومي النهائي. مع العلم أن المواد المستخرجة مشتقة من الأنسجة ذات المحتوى المعزز للورم مع الحد الأدنى من المساهمات من تلوث الأنسجة غير الورمية. سيتم عرض سير العمل متعدد الخطوات لهذه العملية من قبل السيد لي ويسنر والدكتور براندون لارسن وأنا استعدادا لتقسيم الأنسجة ، قم بنقع كتل البارافين على الماء المثلج لمدة 10 إلى 15 دقيقة.تقشعر لها الأبدان الكتل تصلب الشمع في حين أن الماء يرطب الأنسجة ، مما يجعل قطع الأنسجة أسهل. أثناء وجود الكتل على الجليد ، قم بتسمية شرائح المجهر بشكل مناسب. املأ الحمام المائي وسخنه إلى 39 درجة مئوية واضبط الميكروتوم على سمك القطع المطلوب.قم بتحميل الشفرة بعناية على الميكروتوم. قم بقفل الشفرة في مكانها ووضع واقي الأمان حتى تصبح مستعدا لبدء تقسيم الكتل. أثناء وجود واقي الأمان في مكانه ، أدخل كتلة FFPE في ظرف microtome.للبدء ، قسم الكتلة ببطء حتى يتم الحصول على قسم الوجه الكامل. يعرف هذا باسم مواجهة الكتلة. بمجرد تحقيق ذلك ، يمكن أن تكون الكتلة في القسم بشكل أسرع للحصول على شريط من الأقسام.بمجرد القطع ، انقل شريط أقسام الأنسجة إلى حمام الماء الدافئ. استخدم الملقط لفصل مقطع واحد من الأنسجة بعيدا عن الشريط. للقيام بذلك ، ضع الجزء الخلفي من الملقط المنحني المغلق في المفصل بين القسمين واسمح للملقط بالفتح بلطف لفصل الأقسام.اجمع قسم الأنسجة المعزولة على شريحة المجهر. لتجنب محاصرة الفقاعات، أدخل شريحة المجهر في الماء بزاوية. رج الشريحة بلطف لإزالة الماء الزائد قبل وضعها على الرف لتجف في الهواء.بمجرد أن تجف ، حدد واحدا على الأقل من أقسام الأنسجة المقطوعة حديثا لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين ، المعروف أيضا باسم H و E.بمجرد تلطيخ شريحة H و E لمراجعة علم الأمراض. أثناء مراجعة علم الأمراض ، يقوم أخصائي علم الأمراض الخبير بمراجعة شرائح بقع H و E لتحديد مكان الأنسجة ذات الأهمية في كل نسيج. يقوم أخصائي علم الأمراض أولا بمراجعة الأنسجة بأكملها لتحديد مكان وجود الأنسجة ذات الأهمية داخل الأنسجة.بمجرد اكتمال المراجعة الأولية للأنسجة والمورفولوجية ، يستخدم أخصائي علم الأمراض قلم تمييز الشريحة للتعليق على كل شريحة ملطخة H و E. باستخدام العلامة ، يرسم أخصائي علم الأمراض دائرة حول الأنسجة ذات الأهمية ، باستثناء الأنسجة غير المثيرة للاهتمام. ثم تتكرر عملية المراجعة هذه لجميع الشرائح الملطخة H و E في المشروع.قم بإعداد مساحة عمل طاولة التشريح الكلي التي تسمح بمعالجة كل عينة بالتتابع والكفاءة. لكل عينة ، يجب أن تكون H و E التي تمت مراجعتها بشكل مرضي ، وأقسام الأنسجة المثبتة على الشريحة غير الملطخة المقابلة ، بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة المصنفة مسبقا والتي تحتوي على مخزن الهضم العازل لجمع الأنسجة في متناول اليد. قم بتحميل الشرائح غير الملطخة في رف وانتقل إلى غطاء الدخان لإزالة البارافينات.قم بإزالة الشرائح عن طريق غمر الشرائح في غسلتين متتابعتين من D-limonene أو CitriSolv غير المخفف متبوعا بغسل نهائي في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين لكل غسلة. في بداية كل غسلة ، حرك الغسيل بلطف لمدة تتراوح بين خمس و 10 ثوان. لتقليل الترحيل بين الغسولات، اسمح للشرائح بالتصريف لفترة وجيزة وربت الرف على المنشفة الورقية.بعد عمليات الغسيل الثلاثة ، أصبحت الأنسجة الآن مرئية للغاية على شرائح المجهر. اترك الشرائح لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق. بمجرد أن يجف ، يتم وضع H و E وجها لأسفل على المقعد ويتم وضع الأنسجة المنزوعة البارافين في الأعلى ، ووجهها لأسفل أيضا ، واصطفاف الأنسجة المنزوعة البارافين مع H و E.بمجرد محاذاة بشكل صحيح ، يتم تتبع منطقة الورم التي حددها أخصائي علم الأمراض على H و E على الجزء الخلفي من شريحة قسم الأنسجة المنزوعة البارافين.يتم غمس الشرائح غير الملطخة التي تم وضع علامة عليها الآن في محلول جليسيرول بنسبة 3٪ لتقليل جمع الأنسجة الثابتة والمساعدة. قم بإزالة الشرائح المغموسة ببطء لتقليل كمية محلول الجلسرين الذي يتشبث بالشريحة المغموسة. بمجرد إزالتها، امسح الجزء الخلفي من الشريحة وأي مناطق خالية من الأنسجة في الجزء الأمامي من الشريحة لإزالة الجلسرين الزائد.بعد ذلك ، باستخدام شفرة نظيفة ، تتبع علامات علم الأمراض مع الشفرة لكسر الاتصال بين الأنسجة ذات الاهتمام وبقية الأنسجة. مع ملاحظة أنه يمكن القيام بهذه الخطوة قبل غمس الجلسرين ، خاصة إذا كانت العلامات المرضية معقدة لأن قطع الأنسجة الجافة يمكن أن يكون أسهل ويمكن أن يقلل أيضا من خطر سحب الأنسجة. الأنسجة خارج علامات علم الأمراض ليست ذات أهمية.تتم إزالتها باستخدام الحافة المسطحة للشفرة ، مع التأكد من أن زاوية الشفرة تربط خارج علامات علم الأمراض. بمجرد إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، يتم استخدام شفرة جديدة لجمع الأنسجة ذات الاهتمام. ثم تتم إزالة الأنسجة التي تم جمعها من الشفرة باستخدام الطرف المسطح لعصا خشبية ثم يتم نقلها إلى أنبوب صغير محدد مسبقا مع مخزن مؤقت للهضم ، وبالتالي إكمال إثراء أنسجة الورم بوساطة التشريح الكلي ، والتي أصبحت الآن جاهزة لاستخراج الحمض النووي.لتوضيح كيف يمكن أن يؤثر التشريح الكلي على التحليل الجينومي في المراحل النهائية ، تم تشريح أقسام الأنسجة من خمسة أورام ليمفاوية كبيرة منتشرة للخلايا البائية ، أو DLBCL ، مع محتويات الورم المختلفة بشكل كلي أو لم يتم تشريحها بشكل كلي. تم إجراء عمليات استخراج الحمض النووي على الأنسجة التي تم جمعها وفحص الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام اختبار تحديد ملامح التعبير الجيني الرقمي DLBCL90 ، والذي يعرف أيضا باسم فحص التوقيع مزدوج الضربة. يتكون DLBCL من ثلاثة أنواع فرعية جزيئية متميزة ، وهي GCB و ABC ونوعهما الفرعي الوسيط الذي يشار إليه بأنه غير مصنف ، والذي يمكن تحديده باستخدام فحص DLBCL90.هذا الفحص قادر أيضا على تحديد أورام DLBCL التي تؤوي عمليات نقل مزدوجة الضرب تتضمن جين BCL2. تظهر نتائج DLBCL 90 في هذا الجدول. تم تشغيل العينات التي تم تشريحها بشكل كلي مرتين.مرة واحدة باستخدام تركيز مخزون الحمض النووي الريبي الخاص بهم ومرة واحدة باستخدام مخزون الحمض النووي الريبي المخفف لمطابقة تركيز نظرائهم غير التشريح الكلي. تظهر النتائج أن التشريح الكلي أدى إلى تغييرات في النوع الفرعي أو المكالمة المزدوجة في ثلاث من العينات الخمس. لم يكن للتشريح الكلي للعينة A أي تأثير على استدعاء النوع الفرعي ، ولكنه غير المكالمة المزدوجة من سلبية إلى غير مصنفة ، وقد لوحظ هذا التغيير بغض النظر عن إدخال الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كبير.وعلى النقيض من ذلك، لم يكن للتشريح الكلي للعينة C أي تأثير على المكالمة ذات الضربة المزدوجة، ولكنه غير استدعاء النوع الفرعي من GCB إلى غير مصنف، والذي لوحظ أيضا بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كلي. على غرار العينة A ، لم يكن للتشريح الكلي للعينة E أي تأثير على استدعاء النوع الفرعي ، ولكنه غير المكالمة ذات الضربة المزدوجة. ومع ذلك ، بالنسبة للعينة E ، تغيرت المكالمة من غير مصنفة إلى سلبية ، ومرة أخرى ، فعلت ذلك بغض النظر عن مدخلات الحمض النووي الريبي للعينة التي تم تشريحها بشكل كبير.ومن الجدير بالذكر أن هذه المكالمة التي تغيرت إلى سلبية مزدوجة الضربة أمر منطقي بيولوجيا بالنظر إلى أنه تم العثور على العينة E لتكون ABC وتم الإبلاغ عن عمليات نقل مزدوجة الضربة التي تنطوي على BCL2 لوحظت حصريا في أورام GCB. وتسلط هذه النتائج مجتمعة الضوء على أهمية نقاء الورم والمقايسات الجينومية والتشريح الكلي كأداة موثوقة لتحقيق ذلك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لماهية التشريح الكلي ، وأهمية المراجعة المرضية وفوائد الدراسة المكتسبة من خلال تضمين التشريح الكلي في سير عمل معالجة الأنسجة.

enhancing-tumor-content-through-tumor-macrodissection

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف الفيديو تشريح الليزر لنموذج الزراعة العضوية المشتركة ثلاثي الأبعاد بدقة على مستوى الميكرون. في النماذج العضوية ثلاثية الأبعاد ، يتم زراعة المكونات اللحمية مثل الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد مع الخلايا الظهارية السرطانية. يعمل النموذج ثلاثي الأبعاد كأداة تجريبية تمكن من دراسة الغزو وتفاعلات السرطان والسدى في ظروف شبه فسيولوجية.

التشريح المجهري بالليزر: تقنية لعزل خلايا سرطان القولون والمستقيم الغازية من نموذج ثقافة النمط العضوي ثلاثي الأبعاد

يصف هذا الفيديو طريقة للتشريح الكبير اليدوي للأنسجة السرطانية من عينات الأنسجة غير الملطخة للحصول على نسيج سرطاني معين. يمكن معالجة قسم الأنسجة بشكل أكبر للحصول على الحمض النووي للدراسات على مستوى الجينوم حول سرطانات الجهاز الهضمي.

تشريح الأنسجة الورمية FFPE: تقنية للحصول على أنسجة سرطانية معينة من عينات غير ملوثة

يوضح هذا الفيديو اختبار العلاج المساعد أو الإضافي في نموذج فأر مع أورام تحت الجلد مقطوعة بشكل غير كامل. يتم علاج الفأر المستأصل جزئيا من الورم بجسم مضاد يستهدف البروتين المضاد للخلايا السامة للخلايا التائية ، مما قد يقلل من إعادة نمو الورم ويشير إلى علاج مساعد فعال.

علاج مساعد في نموذج فأر مصاب بورم تحت الجلد غير مكتمل

التنميط الجزيئي للخلايا الليزر microdissected وسدى من الاصطناعية، ونماذج سرطان القولون والمستقيم الأنسجة المهندسة يمثل الرواية والنهج manipulatable لتوصيف وتشريح الأحياء المتميزة في مجال التفاعل بين الخلايا السرطانية في الجبهة الغازية وسرطان الخلايا اللحمية المرتبطة.

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

يصف هذا البروتوكول استخدام المجهر multiphoton لأداء الموسعة الوقت الفاصل بين التصوير من التفاعلات متعددة الخلايا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي في قرار خلية واحدة.

تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم

هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

الليزر المجهري (LMD) هو تقنية حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية التي يمكن استخدامها للكشف عن المسارات التي تتوسط عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. هنا، نحن نصف بروتوكول الأمثل لعزل المناطق المنفصلة من أنسجة الورم الدبقي باستخدام الليزر LMD تليها تحليل النسخ.

الليزر التقاط Microdissection من المناطق دون الإقليمية ديوموما للتوصيف المكاني والجزيئي للتغاير داخل الورم، Oncostreams، والغزو

يوفر التعليق التوضيحي الرقمي مع تشريح الأنسجة الآلي نهجا مبتكرا لإثراء الورم في الحالات ذات المحتوى المنخفض من الورم وهو قابل للتكيف مع كل من أنواع البارافين والأنسجة المجمدة. يعمل سير العمل الموصوف على تحسين الدقة والتكرار والإنتاجية ويمكن تطبيقه على كل من الإعدادات البحثية والسريرية.

بروتوكول التشريح الآلي لإثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم

يصف هذا البروتوكول سير عمل عالي الإنتاجية للتجزئة القائمة على الذكاء الاصطناعي للمناطق ذات الأهمية المؤكدة من قبل علم الأمراض من صور قسم الأنسجة الرقيقة الملطخة لإثراء مجموعات الخلايا التي تم حلها بواسطة علم الأنسجة باستخدام التشريح المجهري بالليزر. تتضمن هذه الاستراتيجية خوارزمية جديدة تمكن من نقل الحدود التي تشير إلى مجموعات الخلايا ذات الأهمية المباشرة إلى المجاهر الليزرية.

التشريح المجهري بالليزر الصناعي الموجه بالذكاء الاصطناعي للتحليل البروتيني المجهري للبيئة الدقيقة للورم

تم اقتراح طريقة جديدة للمسح الضوئي 3D ورسم الخرائط الافتراضية لاستئصال السرطان بهدف تحسين التواصل بين فريق رعاية مرضى السرطان متعدد التخصصات.

تعزيز التواصل من هوامش الورم باستخدام المسح الضوئي 3D ورسم الخرائط

تعلم تقنية التشريح الكلي لعينات الأنسجة المطمّرة بالبارافين لتحسين محتوى الورم ودقة التحليل الجينومي. تضمن هذه الطريقة استخراج نواتج ورمية نقية لدراسات موثوقة.

تعزيز محتوى الورم من خلال التشريح الكلي للورم

استكشف المزيد من الفيديوهات