Name: التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: اكتشف آلية تجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي باستخدام تقنية التصوير أحادي الجزيء DNA Curtains. تساعد هذه الطريقة في فهم تنظيم النسخ الجيني وآليات تكون أورام سرطان يوينغ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل منح NSFC رقم 31670762 (Z.Q.).

<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

نظرا لأن نهج الجزيء الواحد حساس للغاية لمحتويات نظام التفاعل ، يجب بذل جهد إضافي لضمان جودة جيدة لجميع المواد والمحاليل أثناء تجارب ستائر الحمض النووي ، وخاصة الدهون المحضرة في القسمين 1 و 2 والمخازن المؤقتة المستخدمة في القسم 5. يجب استخدام الكواشف ذات النقاء العالي لإعداد المخازن المؤقتة ، ويجب تحضير المخازن المؤقتة حديثا للفحص أحادي الجزيء
عندما تم مسح 500 نانومتر mCherry المسمى EWS-FLI1 في الغرفة ، ظهرت العديد من النقاط الأرجواني على الحمض النووي Lambda الذي يحتوي على تسلسل 25× GGAA. لاحظ ...

يعد تنظيم النسخ خطوة حاسمة للتعبير الجيني الدقيق في الخلايا الحية. تشارك العديد من العوامل ، مثل تعديل الكروموسومات وعوامل النسخ (TFs) والحمض النووي الريبي غير المشفر ، في هذه العملية المعقدة1،2،3. من بين هذه العوامل ، تساهم TFs في خصوصية تنظيم النسخ من خلال التعرف على تسلسلات الحمض النووي المحددة المعروفة باسم المروجين أو المعززات وربطها ، وبالتالي تجنيد بروتينات وظيفية أخرى لتنشيط أو قمع النسخ4،5،6،7. كيف تمكنت فرق العمل هذه من البحث عن مواقعها المستهدفة في الجينوم البشري والتفاعل مع الحمض النووي المغلف بالهستونات والبروتينات غير المرتبطة بالحمض النووي قد حيرت العلماء لعقود. في السنوات القليلة الماضية ، تم بناء العديد من النماذج الكلاسيكية لآلية البحث المستهدفة ل TFs لوصف كيفية "الانزلاق" أو "القفز" أو "القفز" أو "النقل بين القطاعات" على طول سلسلة الحمض النووي8،9،10،11. تركز هذه النماذج على سلوك البحث عن الحمض النووي لجزيء TF واحد. ومع ذلك ، تظهر الدراسات الحديثة أن بعض TFs تخضع لفصل الطور السائل والسائل (LLPS) إما بمفردها في النواة أو مع مجمع الوسيط12. ترتبط القطرات المرصودة ل TFs بمناطق المروج أو المحسن ، مما يسلط الضوء على دور تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية في النسخ والجينوم ثلاثي الأبعاد13،14،15. ترتبط هذه المكثفات الجزيئية الحيوية بمقصورات تفتقر إلى الغشاء في الجسم الحي وفي المختبر. يتم تشكيلها عبر LLPS ، حيث تكون الجزيئات الحيوية المعيارية والمناطق المضطربة جوهريا (IDRs) للبروتينات قوتين دافعتين رئيسيتين للتفاعلات متعددة التكافؤ16. وبالتالي ، لا تبحث TFs عن الحمض النووي فحسب ، بل تعمل أيضا بشكل تآزري داخل هذه المكثفات4،17،18. حتى الآن ، لا تزال الخاصية الفيزيائية الحيوية لمكثفات النسخ هذه على الحمض النووي غير واضحة.
لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تطبيق طريقة أحادية الجزيء - ستائر الحمض النووي - لتصوير تكوين وديناميكيات مكثفات النسخ التي شكلتها TFs على الحمض النووي في المختبر مباشرة. تم تطبيق ستائر الحمض النووي ، وهي منصة تصوير عالية الإنتاجية في المختبر لدراسة التفاعل بين البروتينات والحمض النووي ، في إصلاح الحمض النووي19،20،21 ، والبحث المستهدف 22 ، و LLPS17،23،24. يتم طلاء خلية التدفق من ستائر الحمض النووي بطبقات ثنائية دهنية بيوتينيل لتخميل السطح والسماح للجزيئات الحيوية بالانتشار على السطح. تحد الأنماط المتعرجة النانوية من حركة الحمض النووي. يمكن محاذاة ركائز الحمض النووي Lambda Biotinylated على طول حواف الحاجز وتمتد بواسطة التدفق العازل الموجه. تسمح نفس تسلسلات البداية والنهاية لجميع الجزيئات بتتبع البروتين على الحمض النووي ووصف توزيع موضع أحداث الربط25,26. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين ستائر الحمض النووي والفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) يساعد على تقليل ضوضاء الخلفية واكتشاف الإشارات على مستوى جزيء واحد. وبالتالي ، يمكن أن تكون ستائر الحمض النووي طريقة واعدة للتحقيق في ديناميكيات تكوين مكثفات النسخ على أشكال الحمض النووي. تصف هذه الورقة مثال على بروتين ورمي اندماجي لعائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) ، EWS-FLI1 ، الناتج عن إزفاء الكروموسومات. تم استخدام Lambda DNA الذي يحتوي على 25× GGAA - تسلسل الربط ل EWS-FLI127 - كركيزة للحمض النووي في تجارب ستائر الحمض النووي لمراقبة كيفية خضوع جزيئات EWS-FLI1 ل LLPS على الحمض النووي. تناقش هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي وطرق تحليل البيانات بالتفصيل.

<table><tbody><tr><td>488 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبة</td><td>متماسك</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 نانومتر ضخ ليزر الحالة الصلبة</td><td>متماسك</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>أجار</td><td>راون</td><td>R003215-50 جم</td><td></td></tr><tr><td>بيوتينيل DOPE</td><td>أفانتي</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>سيجما</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>كلوروفورم</td><td>أمريسكو</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>طلاء إلكترا 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>الطلاء الواقي الموصل</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I البقر</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>غطاء زجاجي</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>مستخلصات التعبئة Lambda</td><td>Epicenter</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>نيكون المجهر المقلوب</td><td>نيكون</td><td>كسوف Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM مرق</td><td>سيجما</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K ، إيثيل لاكتات 4٪</td> <td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K ، ANISOLE 2٪</td> <td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B كاميرا CMOS العلمية</td><td>القياسات الضوئية</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr> شريحة <tr><td>زجاج السيليكا</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>صمام حقن سداسي</td><td>الاتجاهات Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>مخفف مع ddH 2 O</td></tr> مضخة <tr><td></td><td>جهاز هارفارد</td><td>مضخة 11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 يوديد (491/509)</td> <td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>مخفف ب DMSO</td></tr></tbody></table>

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات ews-fli1 على الحمض النووي

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

تم العثور على جينات الاندماج الناتجة عن نقل الكروموسومات في العديد من الأورام الصلبة أو سرطان الدم. EWS-FLI1 ، الذي ينتمي إلى عائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) من البروتينات السرطانية الاندماجية ، هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في ساركوما إيوينغ. عادة ما تحتوي بروتينات اندماج عائلة FET هذه على مجال منخفض التعقيد (LCD) من بروتين FET في نهايتها N ومجال ربط الحمض النووي (DBD) في نهايتها C. تم التأكيد على أن EWS-FLI1 يشكل مكثفات جزيئية حيوية في مواضع الربط المستهدفة بسبب تفاعلات LCD-LCD و LCD-DBD ، ويمكن لهذه المكثفات تجنيد بوليميراز RNA II لتعزيز النسخ الجيني. ومع ذلك ، فإن كيفية تجميع هذه المكثفات في مواقع الربط الخاصة بها لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق طريقة الفيزياء الحيوية أحادية الجزيء - ستائر الحمض النووي - لتصور عمليات التجميع هذه لمكثفات EWS-FLI1. هنا ، تتم مناقشة البروتوكول التجريبي التفصيلي ونهج تحليل البيانات لتطبيق ستائر الحمض النووي في دراسة المكثفات الجزيئية الحيوية التي تتجمع على الحمض النووي المستهدف.

يظهر الرسم التخطيطي لستائر الحمض النووي في الشكل 1 أ والشكل 1 ب والشكل 1 د. تم العثور على تسلسل الهدف المستنسخ الذي يحتوي على 25 تكرارا غير متقطع ل GGAA في مروج NORB1 في ساركوما إيوينغ. هذا التسلسل المستهدف أمر بالغ الأهمية لتوظيف EWS-FLI128. تم تصور جزيئات EWS-FLI1 من خلال الكشف عن إشارات EWS-FLI1 التي تحمل علامة mCherry والتي تم الحصول عليها باستخدام ليزر 561 نانومتر (الشكل 1C<...

هنا ، نصف استخدام طريقة التصوير أحادية الجزيء ، ستائر الحمض النووي ، لدراسة الآلية الفيزيائية الحيوية لمكثفات EWS-FLI1 المتجمعة على الحمض النووي.

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

نحن نقدم مقايسة جزيء واحد لمراقبة الفصل الطوري لعوامل النسخ على الحمض النووي تسمح هذه التقنية بتحقيق العملية الديناميكية لعوامل النسخ في الوقت الفعلي التي يتم تجميعها كقطرة سائلة على الحمض النووي. EWS-FL1 هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في تكوين ورم ساركوما إيوينغ. يمكن أن يحدد بحثنا العلاقة بين رقم شكل الحمض النووي وتكوين مكثفات EWS-FL1 المرتبطة بنسخ الجينات القاحلة في الخلايا السرطانية ، وربما تكون مفيدة للتشخيص.يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أي مكثفات نسخ أو مجمعات في المختبر ، مثل P53 و MED1. لتحضير خلية تدفق بحواجز نانو متعرجة ملفقة لتجربة ستارة الحمض النووي ، قم بتوصيل أنابيب الإدخال والإخراج في الاتجاه الصحيح. ثم اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للدهون باستخدام حقنتين سعة ثلاثة ملليلتر ، مما يضمن عدم وجود فقاعة في خلية التدفق.أخرج المحقنة من الإخراج وحقن ملليلتر واحد من محلول الجسيمات الشحمية ثلاث مرات مع حضانة لمدة خمس دقائق بين كل حقنة. للشفاء ، أعد غسل خلية التدفق ب 2.5 مل من المخزن المؤقت للدهون ببطء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مخزن BSA المؤقت كما هو مذكور في مخطوطة النص.ثم بعد 30 دقيقة من الشفاء ، اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت BSA من جانب الإخراج. بعد ذلك ، قم بحقن 800 ميكرولتر من مخزن الستربتافيدين في خلية التدفق من جانب الإدخال في خطوتين مع حضانة لمدة 10 دقائق بعد كل خطوة. ثم اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من محلول BSA لإزالة جميع جزيئات الستربتافيدين الحرة.بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي للبيوتين Lambda بزخارف مستنسخة باستخدام مخزن BSA المؤقت وحقنه أربع مرات ببطء كل خمس دقائق. أثناء الحقن ، قم بتشغيل المجهر في نظام أشباه الموصلات أكسيد المعادن العلمي المجاني. ثم اغسل الأنبوب ب 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج واشطف المنشور وموصل الأنبوب بالماء ومنظف كوفيت سائل 2٪ و 99٪ إيثانول.بعد ذلك ، ارسم ما لا يقل عن 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير في حقنة سعة 30 ملليلتر. قم بإعداد خلية التدفق في مرحلة المجهر وقم بتوصيلها بنظام الموائع الدقيقة. باستخدام معدل تدفق 0.03 ملليلتر في الدقيقة ، اغسل جزيئات الحمض النووي إلى الحاجز لمدة 10 دقائق.ثم قم بإيقاف تشغيل نظام الموائع الدقيقة واحتضانه لمدة 30 دقيقة. مع توقف التدفق ، مما يسمح للحمض النووي بالانتشار بشكل جانبي. لتصوير تكوين تكثيف EWS-FLI1 على ستائر الحمض النووي ، افتح برنامج التصوير وابحث عن مواضع الأنماط المتعرجة التسعة تحت المجال الساطع وقم بتمييزها.ثم قم بتشغيل التدفق بمعدل 0.2 ملليلتر في الدقيقة لتلطيخ الحمض النووي بصبغة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف بروتين mCherry EWS-FLI1 باستخدام مخزن التصوير المؤقت بتركيز 100 نانومول في 100 ميكرولتر. ثم قم بتحميل عينة البروتين من خلال الصمام باستخدام حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر وقم بتغيير معدل التدفق إلى 0.4 ملليلتر في الدقيقة.بعد تشغيل الليزر 488 نانومتر ، قم بإجراء مسح مسبق لكل منطقة للتحقق من حالة توزيع الحمض النووي وتحديد المنطقة التي تتوزع فيها جزيئات الحمض النووي بالتساوي. ثم اضبط طاقة الليزر على 10٪ لليزر 488 نانومتر و 20٪ لليزر 561 نانومتر. وباستخدام مقياس الطاقة ، قم بقياس قوة الليزر الحقيقية بالقرب من المنشور.ابدأ في الحصول على الصور على فترتين ثانيتين باستخدام كل من ليزر 488 و 561 نانومتر في وقت واحد. ثم قم بتغيير الصمام من الوضع اليدوي إلى وضع الحقن للسماح للمخزن المؤقت للتصوير بمسح عينة البروتين في خلية التدفق بعد 60 ثانية. لإزالة EWS-FLI1 المجاني ، استمر في غسل خلية التدفق باستخدام مخزن التصوير المؤقت لمدة خمس دقائق مع تشغيل الليزر 561 نانومتر فقط.ثم أوقف التدفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بتشغيل التدفق بمعدل 0.4 ملليلتر في الدقيقة للسماح للحمض النووي بالتمدد والحصول على صور على فترتين ثانيتين بين إطارات مختلفة للحصول على بيانات إنتاجية عالية لتكوين مكثفات EWS-FLI1. تم تصور جزيئات EWS-FLI1 من خلال الكشف عن إشارات mCherry المسماة EWS-FLI1 التي تم الحصول عليها باستخدام ليزر 561 نانومتر.يمكن تصور التكوين المختبري لمكثفات EWS-FLI1 في موقع 25 تكرارا GGAA في ركيزة الحمض النووي مباشرة. تم تأكيد خصوصية mCherry EWS-FLI1 المستخدمة في ستائر الحمض النووي من خلال مقايسة إزاحة الحركة الكهربائية باستخدام قالب الحمض النووي مع وبدون تكرار 25 GGAA بشكل منفصل. عندما تمت معايرة تركيز EWS-FLI1 من 20 إلى 500 نانومول ، زادت شدة EWS-FLI1 بشكل كبير.في حين أن التغيير في شدة FLI واحد DBD كان ضئيلا عندما كانت البروتينات مشبعة لتغطية تكرارات GGAA ، مما يشير إلى أن EWS-FLI1 شكلت مكثفات على الحمض النووي. يجب أن يكون الحقن بطيئا جدا وناعما حتى يتمكن الليبوزوم والحمض النووي من التوزيع بالتساوي على خلية التدفق. من المهم إجراء MSA للتأكد من أن عامل النسخ المنقى يرتبط على وجه التحديد بالتسلسل المستهدف في المختبر.تسمح هذه التقنية للأشخاص باستكشاف ما إذا كانت المكثفات ستسهل البحث المستهدف عن عوامل النسخ وتأثيرها على النسخ.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نقدم الرواية والتكامل قوية من nanophotonics (QD - الحنق) و microfluidics للتحقيق في تشكيل polyplexes polyelectrolyte ، والتي من المتوقع أن يوفر سيطرة أفضل وتوليف polyplexes موحدة وقابلة للحمض النووي في المستقبل على أساس المداواة.

الجمع بين QD - الحنق و microfluidics الحمض النووي لرصد Nanocomplex الذاتي الجمعية في الوقت الحقيقي

يصف هذا الفيديو طريقة لتصور تجميع مكثفات بروتين الاندماج على جزيئات الحمض النووي في مواقع محددة باستخدام التصوير أحادي الجزيء. تتشكل هذه المكثفات بسبب تفاعلات LCD-LCD و LCD-DBD ، والتي تسمح بتجنيد بوليميراز الحمض النووي الريبي II وتحسين نسخ الجينات.

تصوير أحادي الجزيء لتصور تجميع مكثفات بروتين الاندماج على ستائر الحمض النووي

نحن هنا وصف الأدوات والأساليب للكشف عن جزيئات البروتين وحيد fluorescently المسمى-التفاعل مع جزيء DNA واحدة معلقة بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

تقدم هذه الدراسة إجراء التجارب مفصلة لقياس ديناميكية حلقات من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام جزيء واحد نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). يصف البروتوكول أيضا كيفية استخراج كثافة الاحتمال حلقات يسمى عامل J.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يمكن للتصوير الطيفي الإلكتروني تصوير وتمييز الحمض النووي عن البروتين بدقة نانومتر. يمكن دمجه مع نظام miniSOG ، القادر على تسمية البروتينات الموسومة على وجه التحديد في عينات المجهر الإلكتروني الناقل. نوضح استخدام هذه التقنيات باستخدام بؤر إصلاح كسر مزدوجة الخيط كمثال.

تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

يقدم هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية لإجراء فحص بصمة الالتصاق لتصوير أحداث التصاق أثناء التصاق سريع بالخلايا.

التصوير الالتصاق الجزيئي في الخلية المتداول بواسطة Adhesion بصمة المقايسة

يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.

استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء

يتم تقديم العديد من الطرق الشائعة الاستخدام هنا لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء لمستقبلات غشاء البلازما كيناز. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات التفصيلية بما في ذلك تحضير المواد النباتية والمعالجة الدوائية وإعداد التصوير متحد البؤر.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

تقدم هذه المقالة إجراء تجريبيا مفصلا لإعادة تكوين حبال الحمض النووي المحتوية على النيوكليوسوم للقوة المترابطة أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري. كما يصف العديد من التجارب النهائية التي يمكن إجراؤها لتصور سلوك الربط للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين وتحليل التغيرات في الخصائص الفيزيائية للنيوكليوسومات.

تجميع النيوكليوسوم في الموقع للقوة الترابطية أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري

يوضح هذا البروتوكول إجراء اختبار أحادي الجزيء للتصور المباشر لفك الحمض النووي بواسطة CMG helicase. يصف (1) تحضير ركيزة الحمض النووي ، (2) تنقية ذبابة الفاكهة السوداء CMG helicase المسمى بالفلورسنت ، (3) إعداد خلية تدفق الموائع الدقيقة للفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) ، و (4) مقايسة فك الحمض النووي أحادي الجزيء.

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

اكتشف آلية تجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي باستخدام تقنية التصوير أحادي الجزيء DNA Curtains. تساعد هذه الطريقة في فهم تنظيم النسخ الجيني وآليات تكون أورام سرطان يوينغ.

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

استكشف المزيد من الفيديوهات