Name: تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: تعلم تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. هذه الطريقة السريعة والحساسة تساعد الباحثين على فهم استقلاب العظام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم دعم مختبر كارنر من خلال منح المعهد الوطني للصحة R01 (AR076325 و AR071967) إلى C.M.K.

تمت الموافقة على جميع إجراءات الفئران الموضحة هنا من قبل لجان الدراسات الحيوانية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس. تمت الموافقة على بروتوكول الإشعاع من قبل اللجنة الاستشارية للسلامة الإشعاعية في المركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس في دالاس.
1. امتصاص الأحماض الأمينية في الخلايا (البروتوكول الأول)
<ol><li>لوحة 5 × 104 خلايا ST2 في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 12 بئرا. خلايا صفيحية في α-MEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / mL البنسلين و 0.1 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (القلم / العقدية). قم بلوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع في الخطوة 1.12. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.</li>
	<li>زراعة الخلايا لمدة 2-3 أيام حتى التقاء.</li>
	<li>في يوم التجربة ، قم بإعداد الحلول التالية: 1x محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) ، و pH 7.4 و Krebs Ringers HEPES (KRH) ، ودرجة الحموضة 8.0: (120 mM NaCl ، 5 mM KCl ، و 2 mM CaCl 2 ، و 1 mM MgCl2 ، و NaHCO3 ، و 5 mM HEPES ، و 1 mM D-Glucose). السخونة إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>شفط الوسط وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من 1x PBS ، درجة الحموضة 7.4. ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب أيضا للانقسام السريع للخلايا غير الملتقية. في هذه الحالة ، من المهم تطبيع النشاط الإشعاعي إما إلى رقم الخلية المطلق أو محتوى الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، ضع في اعتبارك زيادة حجم لوحة أو قارورة الثقافة لزيادة إجمالي عدد الخلايا وقيم cpm. هذا مهم لتحديد تجريبيا على أساس فردي.</li>
	<li>استنشاق 1x PBS وغسل الخلايا مرة واحدة مع 1 مل KRH.</li>
	<li>اصنع 4 ميكروسيت / مل L-[3,4-3 H]-الجلوتامين وسائط العمل عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-مخزون الجلوتامين لكل 1 مل من KRH. ملاحظة: قبل استخدام المواد المشعة، يرجى الاتصال بمكتب السلامة الإشعاعية في مؤسستك المنزلية للحصول على الموافقات. يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي.</li>
	<li>احتضان الخلايا مع 0.5 مل من KRH تحتوي على 4 μCi / mL L-[3,4-3 H]-وسائط عمل الجلوتامين لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>جمع الوسط المشع وتوزيعه في حاوية النفايات السائلة. اغسل الخلايا ثلاث مرات لفترة وجيزة باستخدام KRH البارد لإنهاء التفاعل. جمع والتخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات السائلة المشعة.</li>
	<li>أضف 1 مل من 1٪ SDS إلى كل بئر و triturate 10x لتحليل الخلايا وتجانسها. انقل التحلل الخلوي إلى أنابيب 1.5 مل. تخلص من ألواح زراعة الخلايا والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي بسرعة >10,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المواد الفائقة إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من الأنابيب وأطراف الماصة في حاوية النفايات المشعة الصلبة.</li>
	<li>اقرأ النشاط الإشعاعي بالأعداد في الدقيقة (cpm) باستخدام عداد اللمعان. تخلص من قوارير التلألؤ في حاوية نفايات قارورة اللمعان.</li>
	<li>التريبسين وإنعاش وإحصاء الخلايا من الصفائح غير المشعة المتبقية من الخلايا (انظر الخطوة 1.1) لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس الدم، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية. تطبيع ال cpm من الخطوة 1.11 إلى رقم الخلية المقدر من الصفائح غير المشعة.</li>
	<li>بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة التلوث من غطاء محرك السيارة ، والمقعد ، وجميع الأدوات باستخدام رذاذ مزيل للملوثات بالنشاط الإشعاعي. وأخيرا، قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.</li>
</ol>2. امتصاص الأحماض الأمينية في أنسجة العظام المعزولة حديثا (البروتوكول الثاني)
<ol><li>قبل تسخين KRH إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>القتل الرحيم لماوس عمره 3 أيام وإزالة الجلد على الذراعين. قم بتفكيك الهوميري من الكتف باستخدام المقص وتشريح كل من humeri. قم بإزالة جميع الأنسجة المؤقتة باستخدام مشرط وملقط. إزالة المشاش من العظام. ملاحظة: بالإضافة إلى humerii ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع عظم الفخذ الوليدي والظنبوب والكالفاريا وكذلك humerii و femora و tibiae المعزولة من الفئران البالغة من العمر 2 و 4 أشهر (بيانات غير منشورة).</li>
	<li>اطرد النخاع من العظم وقم بوزن أعمدة العظام لتطبيعها في الخطوة 2.14.</li>
	<li>غلي عظم العضد في 1x PBS عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا من العظام. يتم استخدام العظم المسلوق decellularized كعنصر تحكم سلبي. ملاحظة: كمراقبة للجودة، قام البارافين بتضمين العظام المسلوقة وغير المسلوقة للبقع النسيجية للتأكد بصريا من أن الغليان كان فعالا في إزالة الخلايا من العظام.</li>
	<li>قم بموازنة كل من هوميري في 1 مل من KRH لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بعمل حل عملي من 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine في KRH عن طريق تخفيف 4 ميكرولتر من 1μCi / μL L-[2,3,4-3 H]- مخزون أرجينين لكل 1 مل KRH. ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لتقييم امتصاص أي من المغذيات ذات العلامات المشعة يتم اختيارها. تم اختبار L-[2,3,4-3 H]-glutamine, L-[14CU]-alanine, و L-[2,3-3 H]-proline بنتائج مماثلة. تظهر بيانات أرجينين لتسليط الضوء على فائدة هذا البروتوكول. تنبيه: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تستخدم الإشعاع خلف الدرع الزجاجي الشبكي أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).</li>
	<li>احتضان كل من عظم التحكم التجريبي والمغلي بشكل منفصل في KRH الذي يحتوي على 4 μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginine لمدة تصل إلى 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: من المهم تحديد أوقات الحضانة تجريبيا لظروف مختلفة بما في ذلك عمر الفئران وعناصر الهيكل العظمي المختلفة وأنواع الأحماض الأمينية المشعة عن طريق إجراء دورة زمنية. يحدث التشبع في الغالب بعد حوالي 3-4 ساعات. يجب تقييم الامتصاص في نقطة زمنية في الغضب الخطي للامتصاص.</li>
	<li>قم بإزالة الوسط المشع والتخلص منه في حاوية النفايات المشعة السائلة. اغسل هوميري ثلاث مرات باستخدام الثلج البارد 1 مل من KRH لإنهاء التفاعل. تخلص من جميع الغسلات في حاوية النفايات المشعة السائلة.</li>
	<li>انقل كل عظمة إلى أنبوب 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); 0.5٪ NP40 (v/v); 0.5٪ DOX (w/v); 0.1٪ SDS (w/v)]. تخلص من ألواح الاستزراع والماصات المصلية وأطراف الماصة في حاوية نفايات صلبة مشعة.</li>
	<li>قم بتجانس هوميري عن طريق تقطيع 100 مرة بالمقص في مخزن مؤقت RIPA.</li>
	<li>سونيكات (السعة: 35 ٪ ، نبض 1 ثانية) العظم المتجانس الناتج لمدة 10 ثوان. ملاحظة: من المعروف أيضا أن الصوتنة تنتج الهباء الجوي. يمكن تنفيذ خطوات الصوتنة في خزانة السلامة البيولوجية. للحد من تكوين الهباء الجوي ، من المهم عدم ملء الأنابيب. يمكن أن يؤدي صوتنة أحجام العينات الصغيرة إلى صوتنة غير مكتملة أو فقدان العينة بسبب الرغوة. في حالة حدوث رغوة ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق حتى تستقر.</li>
	<li>قم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند >10000 × g في درجة حرارة الغرفة. نقل 200 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير تلألؤ تحتوي على 8 مل من محلول اللمعان. اخلطي عن طريق هز قوارير التلألؤ بقوة. تخلص من جميع النفايات المشعة الصلبة (مثل الأنابيب المستعملة، وأطراف الماصة، والألواح، وما إلى ذلك) في حاوية النفايات المشعة الصلبة.</li>
	<li>اقرأ النشاط الإشعاعي (cpm) باستخدام عداد التلألؤ. تخلص من قوارير التلألؤ المستخدمة في حاوية النفايات المشعة المخصصة لقوارير التلألؤ.</li>
	<li>اطرح المقطع المكعب للعظم المغلي (القيمة القاعدية) من المقطع في الدقيقة للعظم التجريبي. تطبيع النشاط الإشعاعي مع وزن العظام من الخطوة 2.3.</li>
	<li>رش غطاء محرك السيارة والأدوات والمقعد المزيل للنشاط الإشعاعي بمحلول إزالة الملوثات من النشاط الإشعاعي. قم بإجراء اختبارات المسح للتأكد من أن منطقة العمل خالية من الإشعاع.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.

يوفر البروتوكول الموصوف هنا نهجا سريعا وحساسا لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية استجابة لمختلف التباديل التجريبية إما في المختبر أو خارج الجسم الحي. بالمقارنة مع المجموعات المتاحة تجاريا (على سبيل المثال ، مجموعة تحديد الجلوتامين والغلوتامات) ، فإن هذه الطريقة أكثر حساسية وأسرع وأقل كثافة في العمالة16،17،25. في بروتوكولنا ، نقوم بتقييم الامتصاص في المخزن المؤقت Krebs Ringers HEPES. نحن نستخدم هذه الوسائط لأنها ترك...

الأحماض الأمينية هي مركبات عضوية تحتوي على مجموعات وظيفية أمينية (-NH2) وكربوكسيل (-COOH) مع سلسلة جانبية متغيرة خاصة بكل حمض أميني. بشكل عام ، تعرف الأحماض الأمينية بأنها المكون الأساسي للبروتين. في الآونة الأخيرة ، تم توضيح الاستخدامات الجديدة ووظائف الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، يمكن استقلاب الأحماض الأمينية الفردية لتوليد مستقلبات وسيطة تساهم في الطاقة الحيوية ، أو تعمل كعوامل مساعدة إنزيمية ، أو تنظم أنواع الأكسجين التفاعلية أو تستخدم لتوليف الأحماض الأمينية الأخرى1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . تظهر العديد من الدراسات أن استقلاب الأحماض الأمينية أمر بالغ الأهمية لتعدد قدرات الخلايا وانتشارها وتمايزها في سياقات مختلفة3،6،11،12،13،14،15،16،17.
الخلايا العظمية هي خلايا إفرازية تنتج وتفرز مصفوفة العظام الغنية خارج الخلية من النوع 1 من الكولاجين. للحفاظ على معدلات عالية من تخليق البروتين أثناء تكوين العظام ، تتطلب الخلايا العظمية إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. لتلبية هذا الطلب ، يجب أن تكتسب الخلايا العظمية بنشاط الأحماض الأمينية. تمشيا مع هذا ، تكشف الدراسات الحديثة عن أهمية امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي في نشاط الخلايا العظمية العظمية وتكوين العظام15،16،17،18،19،20.
تكتسب الخلايا العظمية الأحماض الأمينية الخلوية من ثلاثة مصادر رئيسية: الوسط خارج الخلية ، وتدهور البروتين داخل الخلايا ، والتخليق الحيوي للأحماض الأمينية الجديدة. سيركز هذا البروتوكول على تقييم امتصاص الأحماض الأمينية من البيئة خارج الخلية. تعتمد الطرق الأكثر شيوعا لقياس امتصاص الأحماض الأمينية إما على الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية (على سبيل المثال ، 3H أو 14C) أو النظائر الثقيلة المصنفة (على سبيل المثال ، 13C). يمكن لمقايسات النظائر الثقيلة تحليل امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي بشكل أكثر شمولا وأمانا ولكنها تستغرق وقتا أطول في إكمالها لعدة أيام حيث يستغرق الأمر يوما لإعداد العينات واشتقاقها وعدة أيام للتحليل على مقياس الطيف الكتلي اعتمادا على عدد العينات21,22. وعلى سبيل المقارنة، فإن مقايسات امتصاص الأحماض الأمينية المصنفة إشعاعيا ليست مفيدة حول عملية التمثيل الغذائي في المراحل النهائية ولكنها رخيصة وسريعة نسبيا، حيث يمكن إكمالها في غضون 2-3 ساعات من بداية التجربة23,24. هنا ، نصف بروتوكولا أساسيا قابلا للتعديل بسهولة مصمم لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية المشعة في الخلايا الأولية المستزرعة أو خطوط الخلايا في المختبر أو أعمدة العظام الفردية خارج الجسم الحي. يمكن توسيع نطاق تطبيق هذين البروتوكولين ليشمل الأحماض الأمينية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية وغيرها من أنواع الخلايا والأنسجة المرتبطة بالعظام.

<table><tbody><tr><td>0.25٪ تريبسين</td><td>جيبكو</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>12 بئر لوحة</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1 مل حقنة</td><td>BD الدقة</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G إبرة</td><td>BD الدقة</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>الأرجينين أحادي هيدروكلوريد L- [2،3،4-3H]- ، 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 عداد التلألؤ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>سيجما</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكولين</td><td>سيجما</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - محلول الجلوكوز</td><td>سيجما</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>أداة</td><td></td><td></td> تشريح <td>الملقط ، مقص ، سكيبلز</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>سيجما</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L- [3،4-3H (N)] -Glutamine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td><td></td></tr><tr><td>قوارير التلمع السائل</td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>محلول كلوريد الليثيوم ، 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM & alpha ؛</td><td>أنبوب جيبكو</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي دقيق ، 15 مل</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>سونيكاتور</td><td>سونيك آند المواد</td>: <td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (محلول الوميض)</td> <td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr> <tr><td>& alpha ؛ - (Methylamino) حمض الأيزوبوتيريك</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

يعتمد نمو العظام والتوازن على تمايز ونشاط الخلايا العظمية المكونة للعظام. يتميز تمايز Osteoblast بالتتابع عن طريق الانتشار يليه تخليق البروتين وفي النهاية إفراز مصفوفة العظام. يتطلب الانتشار وتخليق البروتين إمدادات ثابتة من الأحماض الأمينية. على الرغم من ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن استهلاك الأحماض الأمينية في الخلايا العظمية. هنا نصف بروتوكولا حساسا للغاية تم تصميمه لقياس استهلاك الأحماض الأمينية باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. تم تحسين هذه الطريقة لتحديد التغيرات في امتصاص الأحماض الأمينية المرتبطة بانتشار الخلايا العظمية العظمية أو التمايز أو علاجات الأدوية أو عوامل النمو أو التلاعب الجيني المختلف. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة بالتبادل لتحديد استهلاك الأحماض الأمينية في خطوط الخلايا المستزرعة أو الخلايا الأولية في المختبر أو في أعمدة العظام المعزولة خارج الجسم الحي. أخيرا ، يمكن تكييف طريقتنا بسهولة لقياس نقل أي من الأحماض الأمينية وكذلك الجلوكوز والمواد المغذية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية.

يتم تنظيم نقل الأحماض الأمينية من قبل العديد من ناقلات الأحماض الأمينية المرتبطة بالأغشية والتي تم تصنيفها في أنظمة نقل متميزة بناء على العديد من الخصائص ، بما في ذلك خصوصية الركيزة ، والحركيات ، وكذلك الاعتماد على الأيونات والأس الهيدروجيني25. على سبيل المثال ، يمكن التوسط في امتصاص الجلوتامين بواسطة أنظمة النقل المعتمدة على Na + و ASC و γ + L و N أو النظام L المستقل عن Na +. تتميز الأنظمة المعتمدة على Na + بالقدرة على استبدال Li + ب Na + (النظام N...

يقدم هذا البروتوكول مقايسة امتصاص الأحماض الأمينية المشعة ، وهو مفيد لتقييم استهلاك الأحماض الأمينية إما في الخلايا الأولية أو في العظام المعزولة.

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

يعد امتصاص الأحماض الأمينية والتمثيل الغذائي ضروريين لمواصفات الأرومة العظمية والتمايز وتكوين العظام. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وحساسة لتقييم امتصاص الأحماض الأمينية. يستخدم بروتوكولنا الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية لتحديد كمية امتصاص الأحماض الأمينية.إنها طريقة رخيصة وحساسة وسريعة يمكن تعديلها بسهولة لظروف مختلفة. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتقييم امتصاص العناصر الغذائية الأخرى ذات العلامات الإشعاعية مثل الجلوكوز والأحماض الدهنية في مجموعة متنوعة من الأنسجة وكذلك الخلايا الأولية أو المحولة. لبدء امتصاص الأحماض الأمينية لوحة فحص خمس مرات 10 إلى خلايا ST2 الرابعة في كل بئر من 12 بئر لوحة زراعة الأنسجة في ألفا ميم المتوسطة مع استكمال FBS والبنسلين والستربتومايسين.لوحة آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلايا لكل شرط للتطبيع. بعد ذلك ، احتضن الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى التقاء. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا مرتين بملليلتر واحد من PBS عند درجة الحموضة 7.4.ثم قم بشفط PBS قبل غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام HEPES أو KRH الخاص ب Krebs-Ringer بملليلتر واحد. احتضان الخلايا مع 0.5 ملليلتر من KRH الطازجة التي تحتوي على أربعة ميكروكوري لكل ملليلتر L34 وسائط عمل الجلوتامين المثلثة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بجمع الوسط المشع لتوزيعه في حاوية النفايات السائلة.ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات بالثلج البارد KRH لإنهاء التفاعل. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 1٪ إلى كل بئر وقم بتريل الخليط 10 مرات لتحليل الخلايا وتجانسها. ثم انقل الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وقم بتوضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10000 جم لمدة 10 دقائق.انقل الفائق إلى قارورة تلألؤ تحتوي على ثمانية ملليلترات من محلول اللمعان، واقرأ نشاط الراديو والعد في الدقيقة باستخدام عداد اللمعان. من الصفائح غير المشعة المتبقية من الخلايا ، التربسين ، إنعاش ، وحساب الخلايا لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس الدم، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية.لتحديد امتصاص الأحماض الأمينية ، اطرد النخاع من العظم قبل وزن عمود العظام. لإزالة الخلايا من العظم ، قم بغلي عظم العضد في PBS عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بموازنة كل من هوميري الحي والمغلي في ملليلتر واحد من KRH لمدة 30 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.بعد ذلك ، احتضن عظام التحكم التجريبية والمسلوقة بشكل منفصل في KRH الطازج الذي يحتوي على أربعة ميكروكاري لكل ملليلتر L234 ثلاثي الأرجينين لمدة تصل إلى 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد إزالة الوسط المشع ، قم بإنهاء التفاعل عن طريق غسل عظم العضد ثلاث مرات بملليلتر واحد من KRH البارد الجليدي. انقل كل عظمة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 500 ميكرولتر من RIPA Buffer.ثم قم بتجانس عظم العضد و RIPA Buffer عن طريق التقطيع 100 مرة بالمقص ، يليه صوتنة بسعة 35٪ ونبضة ثانية واحدة لمدة 10 ثوان. توضيح الليزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10،000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 200 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير تلألؤ تحتوي على ثمانية ملليلترات من محلول اللمعان.اقرأ النشاط الراديوي باستخدام عداد اللمعان. تم تقييم الخصائص الحركية لامتصاص الجلوتامين المثلث L34 في المختبر وخلايا ST2 المتقاربة في وجود أو عدم وجود حمض إيزوبوتيريك أميني ميثيل الصوديوم أو الليثيوم. أدت إزالة الصوديوم إلى انخفاض بنسبة 90٪ في امتصاص الجلوتامين.أدى وجود الليثيوم إلى زيادة امتصاص الجلوتامين بنسبة 2٪ مقارنة بالحالة الخالية من الصوديوم. في حين أن حمض الميثيل الأميني إيزوبوتيريك لم يؤثر على امتصاص الجلوتامين. وتشير النسبة المئوية التقديرية لمساهمات النظام A أو N أو L أو ASC وغاما زائد L إلى أن معظم امتصاص الجلوتامين يتم بوساطة الأنظمة ASC و gamma plus L.System N مسؤول عن امتصاص الجلوتامين المعتمد على الصوديوم بنسبة 2٪ تقريبا.وأظهر النظام A مساهمة واستيعابا بنسبة 0٪. تم تحليل امتصاص الأرجينين المثلث X-VIVO L34 في هوميري حديثي الولادة المسلوق والحي على مدار ساعتين من الزمن. زاد امتصاص أرجينين خطيا طوال التجربة وعاش هوميري.لم يظهر هوميري المسلوق زيادة ديناميكية في امتصاص الأرجينين في التجربة. يظهر التحليل التمثيلي امتصاص الأرجينين الطبيعي والمصحح. من المهم غلي العظم المقابل كعنصر تحكم نشط.هذه الخطوة ضرورية لأن مصفوفة العظام قد تمتص الأحماض الأمينية المشعة ، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقة. وقد سمح لنا البروتوكول بتأكيد حركية امتصاص الأحماض الأمينية في المختبر وفي الجسم الحي.

evaluation-amino-acid-consumption-cultured-bone-cells-isolated-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

تم استخدام المكتبة عرض فج لتحديد تسلسل الببتيد أن العظام الهدف. كان الهدف هو دراسة تأثير هذه الببتيدات على تمايز الخلايا الوسيطة وتحديد تأثيرها على تجديد العظام.

الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

في هذا الفيديو ، نصف طريقة للكشف عن رواسب الكالسيوم المفرزة من بانيات العظم باستخدام صبغة أنيونية ، Alizarin Red S. يتم تلطيخ بانيات العظم المستنبتة أولا ثم يتم استرداد الصبغة للقياس الكمي اللوني لرواسب الكالسيوم أو درجة تمعدن بانيات العظم.

فحص التمعدن في المختبر: طريقة لقياس الألوان لتحديد رواسب الكالسيوم في الأرودة العظمية على بديل الكسب غير المشروع للعظام عن طريق تلطيخ واستخراج Alizarin Red S

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتقدير امتصاص الأحماض الأمينية بواسطة الخلايا اللحمية المشتقة من نخاع العظام. تتوسط ناقلات الأحماض الأمينية المعتمدة على Na + في امتصاص الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية داخل الخلايا ، ويتم تقدير الامتصاص الخلوي عن طريق قياس النشاط الإشعاعي.

فحص امتصاص الأحماض الأمينية ذات العلامات المشعة لتحديد الامتصاص الخلوي للأحماض الأمينية

وصفنا هنا كيفية إعداد المتوسطة مكيفة العظام (BCM) واختبار نشاطه في المختبر.

العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

ويعرف اليورانيوم لتؤثر على استقلاب العظام. نقدم هنا، بروتوكول يهدف إلى التحقيق أثر التعرض لليورانيوم الطبيعي على استمرارية والتفريق بين وظيفة الآكلة، الخلايا المسؤولة عن ارتشاف العظام.

أساليب لتحليل آثار اليورانيوم الطبيعي في أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر

نقدم بروتوكولا لمقارنة حالة المعادن في حويصلات صدر عن اثنين من خطوط الخلية العظام البشرية: هفوب 1.19 وسوس-2. حللت ملفاتهم التمعدن من الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) تلطيخ، الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الخفيفة التصور والتصوير الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) الإرسال والطاقة المشتتة الأشعة السينية سليكية (EDX).

تحليل المعادن التي تنتجها هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني مع Microanalysis الأشعة السينية المشتتة الطاقة

هنا ، نقدم طريقه للثقافة المجرية السابقة للعظام طويلة murine في مرحلتي الجنين وحديثي الولادة ، ومناسبه لتحليل العظام والغضروف التنمية والتوازن في الظروف التي تسيطر عليها في حين تلخيص عمليه في الجسم المجري.

زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

يقيس فحص التدفق الأيضي للخلايا في الوقت الفعلي معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية ، والذي يتوافق مع إنتاج الميتوكوندريا والأدينوسين ثلاثي الفوسفات المحلل للسكر ، باستخدام أجهزة استشعار الأس الهيدروجيني والأكسجين. تشرح المخطوطة طريقة لفهم حالة الطاقة للخلايا العظمية وتوصيف وتفسير حالة الطاقة الحيوية الخلوية.

استخدام محلل التدفق الأيضي للخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة الطاقة الحيوية لمنطقة العظام

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

يصف هذا البروتوكول تصنيع هياكل عظمية ثلاثية الأبعاد باستخدام خلايا عظمية بشرية مدمجة في هيدروجيلاتين ميثاكريلاتي (GelMA) مع مصفوفة خارج خلايا مفككة الخلية. الطريقة منخفضة التكلفة، قابلة للتوسع، ومتوافقة مع المعدات المختبرية الأساسية، مما يوفر منصة ترجمية لدراسة عمليات أمراض الجهاز العضلي الهيكلي.

منصة ثلاثية الأبعاد لزراعة العظام باستخدام الخلايا العظمية البشرية والمصفوفة خارج الخلايا غير المنفصلة لنمذجة أمراض الجهاز العضلي الهيكلي

تعلم تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة باستخدام الأحماض الأمينية المشعة. هذه الطريقة السريعة والحساسة تساعد الباحثين على فهم استقلاب العظام.

تقييم استهلاك الأحماض الأمينية في خلايا العظام المستزرعة وأعمدة العظام المعزولة

استكشف المزيد من الفيديوهات