أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans
October 14th, 2021
يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.
تم اتباع نهج بسيط لرصد التغيرات في البروتيوستاسيس من خلال تقييم تجميع البولي جلوتامين وتوفير إطار يمكن استخدامه للتطبيقات عالية الإنتاجية. يمكن أن يصبح تسجيل النمط الظاهري مثل عدد المجاميع بواسطة I ذاتيا. تتيح لنا أتمتة العد الكلي القضاء على هذا التحيز وزيادة الإنتاجية والتكرار.
تساعد هذه الطريقة على تحديد الجينات البكتيرية التي تساهم في اضطراب البروتينات المضيفة. سيساعدنا فهم مساهمة الجينات البكتيرية الفردية على فهم آثارها في التسبب في أمراض مثل الزهايمر وباركنسون وهانتنغتون. ابدأ بإزالة الألواح التي تحتوي على الديدان من الفريزر وتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة.
ثم امسح التكثيف الزائد وأزل الغطاء قبل التصوير. استخدم إعدادات المجهر مع وقت التعرض 500 مللي ثانية ، والتكبير 40 × مع محول الكاميرا 0.63 × ، وضبط كثافة GFP على 100٪ أثناء التقاط الصورة. الآن اضبط عناصر التحكم في الضوء المنقول حتى تظهر الديدان مضاءة بشكل ساطع مقارنة بالخلفية المظلمة ، وتجنب التعرض المفرط.
قم بتغيير مواضع الديدان داخل البئر لمنع التكتل المفرط باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لدفع الديدان بلطف إلى الموضع المطلوب. اضبط القناة على مرشح GFP لإنشاء مستوى بؤري لكلتا الصورتين. التقط صورة ميدانية ساطعة.
التقط صورة فلورية مقابلة دون إزعاج اللوحة أو تغيير تركيز المجهر. الآن لتقييم الصور ، قم أولا بتنزيل CellProfiler. افتح البرنامج ، واسحب الصور ذات الأهمية وأفلتها في مربع الصور.
انقر على الصور في قائمة الملفات لفتحها. حدد زجاج المكبر لتمييز منطقة ذات أهمية ورمز السهم لقياس طول كل من الديدان والمجاميع. مرر مؤشر الماوس فوق الكائن المطلوب لتحديد قيمة كثافته، والتي يمكن رؤيتها في الجزء السفلي من الشاشة.
للاستفادة من خط أنابيب تحليل الصور CellProfiler ، قم بتسمية أزواج الصور بشكل صحيح كما هو موضح في مخطوطة النص بعد تنزيل CellProfiler من الموقع الرسمي. قم بتنزيل خط الأنابيب وتحميله إلى CellProfiler عن طريق تحديد الملف والاستيراد وخط الأنابيب من الملف. حدد وحدة الديدان غير المتشابكة لفتح إعداداتها لتحميل مجموعة تدريب تستخدم لتحديد الديدان في وحدة الديدان غير المتشابكة.
ثم حدد اسم ملف مجموعة التدريب. حدد رمز تحميل الملف وقم بتحميل الملف التكميلي أيضا. قم بتحميل الصور عن طريق تحديد وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى.
ثم قم بسحب وإسقاط الصور المسماة بشكل صحيح. قبل تحليل الصور ، حدد مجلد الإخراج المطلوب الذي سيتم استخدامه لتخزين النتائج بالنقر فوق زر إعدادات الإخراج الموجود بالقرب من الزاوية السفلية اليسرى من البرنامج. ثم حدد رمز المجلد على يمين الإخراج الافتراضي لاختيار موقع الإخراج المطلوب.
حدد أيقونة تحليل الصور لبدء تحليل الصور. إذا استغرق التحليل وقتا طويلا لإكماله وتوقف في معالجة صورة واحدة ، فقم بإجهاض التشغيل وتحديد الصورة غير المعالجة عن طريق الفرز من خلال مجلد الإخراج ، وملاحظة اسم الصورة الذي لم يتم العثور عليه. بعد التحليل الكامل ، سيقوم البرنامج بتنظيم النتائج في جدول بيانات Excel يحتوي على ديدان فردية في العمود N ، وعدد المجاميع المعنية في العمود K.Download منظم بيانات التعريف لتنظيم البيانات بسهولة من ملف CSV الناتج من CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Windows ، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخراجه إلى الموقع المطلوب. حدد موقع المجلد المستخرج المسمى gui_Windowsos_64x وافتحه. وقم بتشغيل التطبيق من خلال النقر على أيقونة تطبيق واجهة المستخدم الرسومية.
قد يتم فتح مطالبة تطلب إذنا بالتشغيل. حدد المزيد من المعلومات ثم انقر فوق تشغيل على أي حال. منظم بيانات التعريف جاهز الآن لسحب وإسقاط ملفات CSV الناتجة عن CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Mac OS، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخرج ملف تطبيق منظم البيانات الوصفية للملف. افتح المجلد المستخرج الموجود في التنزيلات. انقر بزر الماوس الأيمن على تطبيق واجهة المستخدم الرسومية وحدد فتح.
ستظهر مطالبة تطلب الإذن بالفتح بسبب عدم وجود ترخيص رسمي. حدد فتح. بمجرد فتح تطبيق منظم البيانات الوصفية الخاص بك في نظام التشغيل المعني ، انقر فوق تحميل ملفاتك هنا ، أو اسحب وأفلت ملفات CellProfiler CSV المطلوبة.
انقر فوق الزر "تنظيم" ، والذي سيجلب المستخدم إلى شاشة جديدة باستخدام زر تنزيل الملفات. انقر فوق الزر وحدد الموقع المطلوب لحفظ ملف الإخراج. سيظهر ملف الإخراج كاسم الملف الأصلي مع إضافة ملحق _organized إلى اسم الملف.
في وجود FODR ، كان للديدان التي تم تغذيتها ببكتيريا مختلفة حجم جسم أكثر اتساقا مما سمح باكتشاف أكثر اتساقا ودقة للديدان ، وبالتالي حل مشكلة الاكتظاظ. أدى تجميد الديدان إلى تحسين اكتشاف الركام polyQ من خلال القضاء على التألق في الخلفية ، بالإضافة إلى دقة العد الآلي مقارنة بالعد اليدوي. تم استخدام إضاءة الحقل الساطع المقلوبة للكشف عن قناة C.elegans و GFP بأكملها لتصوير مجاميع polyQ YFP.
تم الكشف عن الدودة وفك تشابكها وتكميمها المجمعة لكل دودة من خلال تطبيق خط أنابيب محسن لمعالجة صور CellProfiler ، والذي يسمح بالحصول على عدد المجاميع لكل دودة فردية. كان الفرق بين فعالية القياس الكمي الكلي الآلي واستخدام خط أنابيب CellProfiler ضئيلا ، مما يشير إلى أنه يمكن تطبيق الطريقة الآلية على شاشات واسعة النطاق. من بين 90 سلالة بكتيرية تم اختبارها ، أظهر استعمار أمعاء C.elegans مع مرشح واحد انخفاضا كبيرا في عدد المجاميع.
كشفت تجارب التأكيد عن طريق العد اليدوي أن أيا من الطفرات ، بما في ذلك تلك التي خفضت بشكل كبير عدد المجاميع أثرت على تجميع polyQ. يجب على الباحثين الذين يقررون استخدام هذا الإطار أن يفهموا أن الخطوات الموضحة ليست مطلقة. يعد التعديل والفهم الأساسي لكيفية التعامل مع CellProfiler ضروريين للنجاح.
يمكن استخدام مناهج كيميائية حيوية إضافية مثل النشاف الغربي لتأكيد تجميع polyQ.
نظرة عامة
تطوّر هذه الدراسة سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان، والتصوير بالفلورسنت، ومعالجة الصور الآلية لتحديد كميات تراكمات البوليغلوتامين كمقياس للتغيرات في التوازن البروتيني. تعزز الطريقة تقييم هذه التراكمات، خاصة في استكشاف دورها في الأمراض التنكسية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- التوازن البروتيني
- الأمراض التنكسية العصبية
- الفحص عالي الإنتاجية
الخلفية
- يرتبط تراكم البوليغلوتامين بأمراض مثل الزهايمر، باركنسون، وهنتنغتون.
- فهم مساهمات الجينات البكتيرية في اضطراب التوازن البروتيني أمر ضروري.
- يمكن أن تكون طرق التقدير التقليدية للتراكمات ذاتية.
الطرق المستخدمة
- التصوير والتحليل عالي الإنتاجية باستخدام CellProfiler
- C. elegans كنموذج بيولوجي
- التقدير الآلي لتراكمات البوليغلوتامين
النتائج الرئيسية
- تسمح معالجة الصور الآلية بالقضاء على التحيز وزيادة القدرة على التكرار في عد التراكمات.
- تم تحديد الجينات البكتيرية التي تؤثر على التوازن البروتيني للمضيف مع نتائج مهمة في عدد تراكمات الدودة.
- تشير النتائج المعتمدة إلى أن التشغيل الآلي قابل للمقارنة مع العد اليدوي، مما يدعم الفحوصات واسعة النطاق.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة إطارًا موثوقًا لدراسة التوازن البروتيني من خلال تراكم البوليغلوتامين.
- الرؤى المكتسبة من هذه الطريقة ذات صلة لفهم الآليات في الأمراض التنكسية العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
