إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال (siRNA) باستخدام جهاز الموائع الدقيقة
مارس 22, 2022
جذبت طرق إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية القائمة على الموائع الدقيقة (LNP) الانتباه في أنظمة توصيل الأدوية (DDSs) ، بما في ذلك تسليم الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول عمليات التصنيع وإنتاج LNP (LNP المحمل بواسطة siRNA) وعمليات تقييم LNP باستخدام جهاز الموائع الدقيقة الأصلي المسمى iLiNP.
يؤثر حجم الجسيمات النانوية الدهنية على التوزيع الحيوي ، والتأثير المضاد للورم ، وأداء إسكات الجينات. لذلك ، فإن طريقة التحكم في حجم LNP هي تقنية فعالة لإنتاج أدوية النانو ، بما في ذلك أنظمة توصيل الحمض النووي الريبي. كان هذا الجهاز الموائع الدقيقة الأصلي ، المسمى جهاز iLiNP ، قادرا على التحكم في حجم LNP الذي يتراوح من 20 إلى 100 نانومتر على فترات 10 نانومتر.
يمكن لجهاز iLiNP إنتاج ليس فقط LNPs المحملة ب siRNA ، ولكن أيضا جميع LNPS المحملة بالحمض النووي الريبي ، و LNPs المحملة بالبروتين الريبي. للبدء ، خذ محاليل الإيثانول الدهنية وأنتج LNPs المحملة ب siRNA عن طريق خلط حلول DOTAP و DSPC و cholesterol و DMG-PEG2k بنسبة مولية من 50 إلى 10 إلى 38.5 إلى 1.5. اضبط تركيز الدهون الكلي على ثمانية ملليمول.
ثم خذ المحاليل المائية من 154 مللي مولا ملحي و 25 ملليمولار خلات عازلة عند الرقم الهيدروجيني 4 وقم بتصفيتها من خلال مرشحات غشاء 0.2 ميكرومتر أو مرشحات محاقن. قم بتحضير محلول siRNA المخزن المؤقت عن طريق إذابة 70 ميكروغرام من siGL4 في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لخلات 25 ملليمولار. املأ محاقن زجاجية واحدة بملليلتر بمحاليل دهنية ومائية ، على التوالي.
قم بتوصيل المحاقن الزجاجية بالشعيرات الدموية القصوى باستخدام موصلات المحاقن ، ثم اضبط معدل تدفق المحاليل الدهنية والمائية وأدخل المحاليل الدهنية والمائية بشكل منفصل في جهاز iLiNP باستخدام مضخات المحاقن. اجمع معلقات LNP في أنبوب دقيق من مخرج جهاز iLiNP. قم بتحويل تعليق LNP باستخدام غشاء غسيل الكلى من 12 إلى 14 كيلودالتون قطع الوزن الجزيئي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ضد المالحة أو DPBS ل POPC LNPs و siRNA المحملة LNPs ، على التوالي.
اجمع معلقات LNP المشوهة في أنابيب دقيقة ثم قم بسحب 20 إلى 30 ميكرولتر من تعليق LNP إلى خلية كوارتز صغيرة. أخيرا ، قم بقياس حجم LNP وتوزيع حجم LNP ومؤشر تشتت poly عن طريق تشتت الضوء الديناميكي. يتم عرض توزيع حجم POPC LNP المنتج في ظروف تدفق مختلفة ، مثل معدل التدفق الكلي ونسب معدل التدفق هنا.
يمكن التحكم في أحجام LNP الدقيقة التي تتراوح من 20 إلى 100 نانومتر باستخدام جهاز iLiNP هذا. يتم تشكيل LNPs صغيرة الحجم في ظروف معدل التدفق الكلي العالية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحجام LNP التي يتم تشكيلها في FRR 5 أصغر من أحجام FRR 3 ، بغض النظر عن معدل التدفق الكلي.
يظهر توزيع حجم LNPs المحملة ب siRNA هنا. يتم تغليف siRNAs في LNPs عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي بين DOTAP الدهون الكاتيونية و siRNAs سالبة الشحنة. أنتج جهاز iLiNP 90 نانومتر من LNPs الكاتيونية المحملة بالحمض النووي الريبوزي المرسال مع توزيع ضيق.
كانت كفاءة تغليف siRNA 95٪ بسبب التفاعل الكهروستاتيكي بين الدهون الكاتيونية و siRNAs سالبة الشحنة. تم تقييم السمية الخلوية ونشاط إسكات الجينات ل 19 نانومتر من الحمض النووي الريبي المحمل بالحمض النووي الريبوزي المرسال. أظهرت LNPs المحملة ب siRNA سمية خلوية بجرعة 10 إلى 100 نانومولار siRNA.
انخفض مستوى التعبير عن luciferase اعتمادا على تركيز siRNA. قامت LNPs المحملة ب siRNA بقمع تعبير لوسيفيراز بنسبة 80٪ بجرعة 100 نانومولار siRNA. تعد تحسينات ظروف التدفق أهم الخطوات في البروتوكول للحصول على LNPs ذات الحجم المطلوب.
لا تتطلب طريقة إنتاج LNP القائمة على الموائع الدقيقة بما في ذلك جهاز iLiNP أي إجراء معقد ومن المتوقع أن يتم استخدامها كطريقة إنتاج LNP القياسية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لإنتاج جسيمات نانوية دهنية (LNPs) محملة بـ siRNA باستخدام جهاز ميكروفلويديك يسمى iLiNP. تسمح هذه الطريقة بالتحكم الدقيق في حجم الـ LNP، وهو أمر بالغ الأهمية لأنظمة توصيل الأدوية الفعالة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أنظمة إيصال الأدوية
- الجسيمات النانوية الدهنية
- الموائع الدقيقة
خلفية علمية
- يؤثر حجم الجسيمات النانوية الدهنية على التوزيع الحيوي والفعالية العلاجية.
- يعد التحكم في حجم الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) أمراً أساسياً لتحسين توصيل الحمض النووي الريبي (RNA).
- يتيح جهاز iLiNP التحكم في الحجم من 20 إلى 100 نانومتر.
- تسهل التفاعلات الكهروستاتيكية تغليف siRNA داخل الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs).
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لإنتاج جسيمات نانوية دهنية (LNPs) محملة بـ siRNA.
- تقييم تأثير حجم الجسيمات النانوية الدهنية على كفاءة إسكات الجينات.
- تحسين ظروف التدفق للوصول إلى الخصائص المطلوبة للجسيمات النانوية الدهنية.
الطرق المستخدمة
- تحضير المحاليل الدهنية والمائية لإنتاج الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs).
- استخدام جهاز iLiNP للخلط وتكوين الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs).
- ديالزة معلقات الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) لإزالة المواد الزائدة.
- استخدام تشتت الضوء الديناميكي لقياس حجم الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) وتوزيعها.
النتائج الرئيسية
- أنتج جهاز iLiNP جسيمات نانوية دهنية (LNPs) محملة بـ siRNA بحجم 90 nanometers وكفاءة تغليف بلغت 95%.
- تكونت جسيمات LNPs صغيرة تحت ظروف معدل تدفق إجمالي مرتفع.
- أظهرت جسيمات LNPs المحملة بـ siRNA سمية خلوية وإسكاتاً جينياً فعالاً.
- كانت ظروف التدفق المُحسَّنة حاسمة لتحقيق أحجام LNP المطلوبة.
الاستنتاجات
- تسهّل الطريقة الموائع مجهرية باستخدام جهاز iLiNP عملية إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية (LNP).
- من المتوقع أن يؤدي هذا النهج إلى توحيد معايير إنتاج الجسيمات النانوية الدهنية في الأبحاث.
- يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف تطبيق هذه الطريقة في أنظمة توصيل RNA المختلفة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعد التحكم الدقيق في حجم الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) أمراً بالغ الأهمية لتحسين التوزيع الحيوي، والفعالية العلاجية، وأداء إسكات الجينات في أنظمة توصيل الأدوية القائمة على RNA. يتيح جهاز iLiNP للموائع الدقيقة إنتاج جسيمات LNP قابلة للتكرار وبحجم يمكن ضبطه من 20 إلى 100 نانومتر، مما يدعم سير عمليات التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة في المراحل المبكرة. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال تقليل التباين في أداء الجسيمات النانوية، وهو عامل رئيسي في تقليل المخاطر المرتبطة بالتقدم الانتقالي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء النشاط البيولوجي المعتمد على الحجم لجسيمات LNP المحملة بـ siRNA في فحوصات التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توفر تركيبات LNP معيارية لتقليل الضوضاء في عمليات الفرز المظهري ودراسات تقليل المخاطر الآلية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج جسيمات نانوية دهنية محملة بـ siRNA (siRNA-LNPs) أحادية التشتت بحجم محدد وكفاءة تغليف تصل إلى 95% لضمان تقييم موثوق للمركبات.
- القيمة التشغيلية: دعم توحيد المقاييس من خلال التحكم القابل للتكرار في حجم جسيمات LNP عبر ضبط معدل التدفق في جهاز iLiNP.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: تسهل ربط حجم الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) بكفاءة إسكات الجينات والسمية الخلوية في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- القيمة التشغيلية: تتيح الإنتاج القابل للتطوير من الجسيمات النانوية الدهنية المحملة بـ mRNA وsiRNA والبروتينات النووية الريبوزية لضمان الاستمرارية في الدراسات قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج طريقة الموائع الدقيقة iLiNP ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف ووصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم التطوير قبل السريري، خاصة فيما يتعلق بالعلاجات القائمة على RNA حيث يؤثر التوصيل المعتمد على الحجم على الفعالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين التغيير المنهجي في حجم الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) لتقييم التأثير على الامتصاص الخلوي والارتباط بالهدف.
- الفحص: توفر تركيبات LNP جاهزة للمقايسة مع توزيع متسق للحجم وتغليف عالٍ لـ siRNA لضمان تكرارية فحص المركبات.
- التحليلات: توفر مخرجات كمية للحجم، وتعدد التشتت، وجهد زيتا عبر تشتت الضوء الديناميكي لتوجيه قرارات المتابعة أو الإيقاف.
- الأبحاث الانتقالية: تربط تحسين LNP في مرحلة الاكتشاف بالتقييم قبل السريري من خلال أدوية نانوية معيارية ومحكومة الحجم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لإنتاج أنواع مختلفة من LNPs المحملة بـ RNA (مثل siRNA و mRNA و RNP) عبر مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يحسن الثقة في الهدف من خلال ربط الخصائص الفيزيائية والكيميائية لجسيمات LNP بالنتائج الوظيفية مثل إسكات الجينات.
- القيمة التشغيلية: يعزز إمكانية تكرار إنتاج LNP وقابلية التوسع من خلال دقة الموائع الدقيقة.
- القيمة الاستراتيجية: يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال تمكين التخفيف المبكر من مخاطر أداء مركبة التوصيل.
- تأثير المحفظة: يوجه عملية ترتيب أولويات المرشحين للعلاجات القائمة على RNA المعدلة حسب المخاطر بناءً على كفاءة التوصيل.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تركيب الدهون، والتعامل مع الموائع الدقيقة، وتحميل الأحماض النووية.
- يعتمد على مضخات الحقن، والمحاقن الزجاجية، وبنية تحتية للديلزة من أجل تنقية الجسيمات النانوية الدهنية (LNP).
- يستلزم توحيد نسب معدل التدفق وظروف التدفق الإجمالي بين الفرق المختلقة.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تغيير تركيبات الدهون أو أنواع حمولة RNA.
- محدود بالحاجة إلى إجراء الديلزة بعد الإنتاج واستخدام تشتت الضوء الديناميكي لمراقبة الجودة.
الأسئلة الشائعة حول المستحضرات الصيدلانية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
