إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون
نوفمبر 20, 2021
وقد استخدمت monolayers الدهون كأساس لتشكيل بلورات البروتين ثنائي الأبعاد (2D) للدراسات الهيكلية لعقود. فهي مستقرة في واجهة الهواء والماء ويمكن أن تكون بمثابة مادة داعمة رقيقة للتصوير الإلكتروني. هنا نقدم الخطوات المثبتة على إعداد monolayers الدهون للدراسات البيولوجية.
على مر السنين، وقد استخدمت Monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تبلور 2D، وبعض البروتينات غشاء لا يتجزأ. ولكن يتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية الدهون.
تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة ماء الهواء ، بحيث تظل مجموعات الرأس القطبية للدهون رطبة في المرحلة المائية. وذيول أسيل غير القطبية من القسم الدهون إلى واجهة مياه الهواء، الذي يكسر التوتر السطحي وتسطيح سطح الماء. تهمة طبيعة moieties الكيميائية المميزة للمجموعات رئيس الدهون توفير تقارب للبروتينات في الحل.
تعزيز الربط، وفي تكوين الصفيف 2D المبدأ. يمكن نقل أي بلورات ثنائية الأبعاد تتشكل على طبقة أحادية الدهون بسهولة إلى المجهر الإلكتروني على شبكة EM مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري على طبقة الدهون. وصفنا في هذه المخطوطة، منهجية أحادية الطبقة للدهون لتصوير المجهر الإلكتروني المبرد.
إعداد أحادي الطبقة الدهون. إعداد مخزون الدهون، وإعداد 0.01 ملغ لكل مل خليط الدهون في حجم 9:1 لحجم الكلوروفورم، الميثانول. باستخدام 8.91 مل من الكلوروفورم و 0.99 مل من الميثانول و 0.1 مل من محلول 10 ملغ لكل مل من الدهون.
إعداد لوحة تفلون. سونيكاتي لوحة تفلون في حمام الميثانول لمدة خمس دقائق. يغسل بالماء الساخن لمدة 15 دقيقة ثم يشطف بالماء المقطر.
جفف صفيحة تفلون في مجفف لمدة 30 دقيقة وأبقها تحت الفراغ حتى الاستخدام. تشكيل أحادي الطبقة الدهون على خزان العازلة. وقت التشغيل المقدر سيكون ساعة ونصف.
ضع ورقة تصفية من نوع واحد في طبق بيتري وقم بترتيب كتلة تفلون أعلى ورقة التصفية. ملء الآبار من لوحة تفلون مع 60 ميكرولتر من العازلة. إضافة بعناية خليط السائل على رأس سطح العازلة قطرة قطرة.
من الناحية المثالية واحد ميكرولتر لكل قطرة باستخدام حقنة هاملتون. بلل ورق الفلتر بالماء المقطر و حافظ على الرطوبة في طبق بيتري. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة، يجب أن يتبخر الكلوروفورم وينبغي تشكيل طبقة أحادية من الدهون على سطح المخازن المؤقتة.
تطبيق شبكة EM على طبقة أحادية الدهون. وقت التشغيل المقدر ساعة ونصف. ضع بلطف شبكة EM المغلفة بالكربون دون توهج تفريغ جانب الكربون لأسفل على سطح كل خزان عازل.
حقن البروتينات بعناية في حقن الجانب جيدا، واستخدام تركيزات البروتين النهائي في البئر حول ميكرومولار واحد. احتضان 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حقن بلطف ما يقرب من 20 إلى 30 ميكرولتر من العازلة في منفذ الحقن الموقع لرفع الشبكة فوق سطح كتلة تفلون.
هذا يسمح لك لالتقاط الشبكة مع زوج من الملاقط ورفعه عموديا قبالة القطيرات. النتائج التمثيلية. يمكن تصور طبقة أحادية الدهون المودعة على شبكة EM تحت المجهر الإلكتروني الإرسال دون تلطيخ التباين.
يمكن التعرف على وجود أحادي الطبقة ، من خلال الفرق التباين من المنطقة دون أي عينة في مسار الحزمة هذا. المناطق التي لديها تغطية أحادية الطبقة الدهنية لديها تباين أقل من تلك التي لا تغطيها. منذ شعاع الإلكترون من خلال الثقوب الفارغة لا يوجد لديه التشتت فإنه يظهر إضاءة أكثر إشراقا.
في الختام، طريقة أحادية الطبقة الدهنية يوفر فرصة لدراسة هياكل البروتين بسبب بساطته. وقد يوفر نهجا بديلا لتسهيل عملية التبلور 2D.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تُعد الطبقات الدهنية أحادية الجزيئات بمثابة أساس مستقر للبلورة ثنائية الأبعاد للبروتينات، مما يسهل الدراسات الهيكلية. وتعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لبروتينات الغشاء الطرفية والبروتينات الذائبة، كما يمكن تكييفها لبروتينات الغشاء المدمجة من خلال التحسين الدقيق.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الفيزياء الحيوية
- البيولوجيا البنيوية
- الكيمياء الحيوية
خلفية علمية
- تتشكل الطبقات الأحادية الدهنية عند السطح الفاصل بين الهواء والماء.
- تظل مجموعات الرؤوس القطبية مميهة في الطور المائي.
- تتوزع الذيول الأسيلية غير القطبية عند السطح الفاصل بين الهواء والماء.
- تؤثر الطبيعة الكيميائية لمجموعات الرؤوس الدهنية على ألفة البروتين.
الغرض من الدراسة
- تقديم طريقة لتحضير الطبقات الدهونية الأحادية.
- دعم بلورة البروتينات المختلفة.
- تعزيز الدراسات البنيوية من خلال تحسين تقنيات التصوير.
الطرق المستخدمة
- تحضير الطبقات الدهنية أحادية الجزيئات عند الواجهة بين الهواء والماء.
- تحسين ظروف المنظفات والديال.
- الدراسة التجريبية لتوزيع البروتين.
- تقنيات التصوير الإلكتروني للتحليل البنيوي.
النتائج الرئيسية
- تدعم الطبقات الأحادية الدهنية تبلور البروتينات بشكل فعال.
- تعزز ظروف محددة من ألفة البروتينات تجاه الطبقة الأحادية.
- يمكن بلورة البروتينات الغشائية المدمجة من خلال مزيد من التحسين.
- توفر هذه الطريقة منصة مستقرة للتصوير الإلكتروني.
الاستنتاجات
- تعد الطبقات الأحادية الليبيدية أداة متعددة الاستخدامات في البيولوجيا البنيوية.
- فهي تسهل دراسة بروتينات الغشاء الطرفية والمدمجة على حد سواء.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لتحسين الظروف من أجل الحصول على أفضل النتائج.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
تتيح طرق الطبقة الأحادية الدهنية تبلور البروتين المتحكم به في بُعدين، مما يدعم التحديد البنيوي للأهداف الغشائية والقابلة للذوبان. ويعزز هذا النهج من عملية التحقق من الأهداف من خلال توفير منصات قابلة للتكرار للتوصيف الفيزيائي الحيوي، مما يقلل من حالة عدم اليقين في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية. كما تسهل هذه التقنية تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال رؤى بنيوية عالية الدقة، مما يوجه عمليات تحسين المركبات الرائدة وقرارات إدارة المحافظ الدوائية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء التفاعلات بين البروتين والليبيدات والحالات التشكلية ذات الصلة بوظيفة الهدف.
- القيمة التشغيلية: يوفر نظاماً معيارياً لتقييم استقرار الهدف وقدرته على الارتباط.
- القيمة العلمية: يدعم التحقق الوظيفي من الهدف من خلال السماح بالتحليل البنيوي في ظروف قريبة من الحالة الطبيعية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج مصفوفات بروتينية متجانسة ومنظمة مناسبة لتطبيقات الفرز عالية الدقة.
- القيمة التشغيلية: ضمان تكرار النتائج في تحضير العينات، وهو أمر بالغ الأهمية لاتساق المقاييس بين الفرق المختلفة.
- القيمة العلمية: إنتاج مخرجات هيكلية قابلة للقياس الكمي تتيح الربط مع بيانات المقاييس الوظيفية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوفر رؤى هيكلية حول البروتينات الغشائية المستهدفة، مما يساعد في فهم آليات المرض.
- القيمة التشغيلية: يُنتج عينات قابلة للنقل ومتوافقة مع سير عمل المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) اللاحق.
- القيمة العلمية: يدعم الثقة التنبؤية من خلال ربط الميزات الهيكلية بالنشاط الدوائي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندمج طريقة الطبقة أحادية الجزيئات الدهنية في سير عمل الاكتشافات المبكرة، مما يدعم التحقق من الهدف وتحديد المركبات الرائدة من خلال التوصيف البنيوي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات من خلال التصوير البنيوي لترتيبات البروتين وتفاعلاته.
- الفحص: تتيح الجاهزية للمقايسات من خلال إنتاج بلورات ثنائية الأبعاد منتظمة لضمان اتساق القياسات الفيزيائية الحيوية.
- التحليلات: توفر بيانات تصوير عالية الدقة تتيح للفرق مقارنة الحالات البنيوية تحت ظروف متنوعة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج البنيوية بالاستمرارية قبل السريرية من خلال توضيح آليات الأهداف.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام للفحص البنيوي عبر أهداف بروتينية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال الملاحظة الهيكلية المباشرة.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي في تحضير العينات للدراسات الهيكلية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل عدم اليقين الهيكلي في اختيار الهدف.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر بناءً على البيانات الهيكلية والوظيفية التي تم التحقق من صحتها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الدهون، وتنقية البروتينات، وعلم الواجهات البينية.
- يعتمد على توفر معدات متوافقة مع الغرف النظيفة، مثل محاقن Hamilton وركائز Teflon.
- يستلزم توحيد ظروف المحلول المنظم وأوقات الحضن عبر المختبرات المختلفة.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع فئات البروتينات المختلفة، ولا سيما بروتينات الغشاء المدمجة.
- يتقيد بالحاجة إلى التحسين التجريبي لظروف المنظفات والديلزة لبعض الأهداف.
