Name: الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: تعلم طرق قياس نشاط إنزيمات استقلاب الجليكوجين باستخدام المطياف الضوئي البسيط. هذه التقنيات غير مشعة ومنخفضة التكلفة وتتيح للباحثين دراسة عمليات التمثيل الغذائي بأمان ودقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلف أن يشكر كارولين ديتمر وأندرو بريتنغهام على رؤيتهما والعديد من المناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من صندوق أيوا للتعليم والبحث في تقويم العظام (IOER 03-17-05 و 03-20-04).

<ol><li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li>
<li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li>
<li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li>
<li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase%2C+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li>
<li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose%3A1%2C4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li>
<li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li>
<li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li>
<li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1%2C6-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li>
<li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li>
<li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li>
<li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li>
<li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li>
<li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li>
<li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C+6-diphosphatase%2C+phosphofructokinase%2C+glycogen+synthetase%2C+phosphorylase%2C+and+protein+kinase+from+swine+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li>
<li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).</li>
<li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1%2C6-glucosidase-oligo-1%2C4-1%2C4-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li>
<li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification%2C+properties+and+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li>
<li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain%3A+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li>
<li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+EYC+%22The+Enzymes+Vol.+5%22">The Enzymes Vol. 5</a>. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).</li>
<li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+of+amylose+and+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li>
<li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1%2C4%2C-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltansferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li>
<li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li>
<li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li>
<li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li>
<li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li>
<li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis%3A+An+unusual+member+of+the+starch%2Fglycogen+synthase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-1%2C4-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li>
<li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+oyster+glucogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li>
<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

لا يوجد تضارب معروف في المصالح مرتبط بهذا العمل ولم يكن هناك دعم مالي لهذا العمل يمكن أن يؤثر على نتائجه.

بشكل عام ، تتمثل المزايا الرئيسية لجميع الطرق المقدمة في تكلفتها المنخفضة وسهولتها وسرعتها وعدم الاعتماد على المعدات المتخصصة. العيب الرئيسي الذي يشتركون فيه جميعا هو الحساسية مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة. من السهل تقدير حساسية الإجراءات التي تنطوي على إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH. بالنظر إلى أن معامل الانقراض ل NADH / NADPH هو 6.22 M-1 cm-1 ، يشير الحساب البسيط إلى أنه يمكن اكتشاف ~ 10-20 μM من التغيرات في التركيز بسهولة. مع أحجام الفحص الموضحة في المقالة الحالية ، يتوافق هذا مع القدرة على قياس ال...

ينتشر الجليكوجين على نطاق واسع في الطبيعة ، حيث يوجد المركب في البكتيريا والعديد من الطلائعيات والفطريات والحيوانات. في الكائنات الحية الدقيقة ، يكون الجليكوجين مهما لبقاء الخلية عندما تكون العناصر الغذائية محدودة ، وفي الكائنات الحية العليا مثل الثدييات ، يعمل تخليق وتدهور الجليكوجين على تخزين مستويات الجلوكوز في الدم1،2،3. وبالتالي ، فإن دراسة استقلاب الجليكوجين لها أهمية في مجالات متنوعة مثل علم الأحياء الدقيقة وعلم وظائف الأعضاء في الثدييات. يتطلب فهم استقلاب الجليكوجين دراسة الإنزيمات الرئيسية لتخليق الجليكوجين (سينسيز الجليكوجين والإنزيم المتفرع) وتدهور الجليكوجين (فسفوريلاز الجليكوجين وإنزيم debranching). تستخدم المقايسات القياسية الذهبية لأنشطة إنزيم الجليكوجين سينسيز ، والفوسفوريلاز ، والتفرع ، وأنشطة الإنزيم المتفرعة نظائر مشعة. على سبيل المثال ، يتم قياس سينسيز الجليكوجين بشكل عام في مقايسة كيميائية إشعاعية متوقفة باتباع دمج الجلوكوز من UDP- [14 C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات الحيوانية والفطرية) أو ADP- [14C] الجلوكوز (في حالة الإنزيمات البكتيرية) في الجليكوجين 4,5. وبالمثل ، يتم قياس فسفوريلاز الجليكوجين في اتجاه تخليق الجليكوجين ، بعد دمج الجلوكوز من [14C] الجلوكوز -1-فوسفات في الجليكوجين6. يتم فحص الإنزيم المتفرع عن طريق قياس قدرة هذا الإنزيم على تحفيز دمج [14 C] الجلوكوز من الجلوكوز -1-فوسفات في سلاسل مرتبطة α1،4 بواسطة الجليكوجين فسفوريلاز7 ، ويتم تحديد نشاط إنزيم إزالة التفرع باتباع قدرة الإنزيم على دمج [14C] الجلوكوز في الجليكوجين8 . في حين أن الركائز المشعة حساسة للغاية ، مما يسمح باستخدامها في مستخلصات الخلايا الخام ذات المستويات المنخفضة من نشاط الإنزيم ، إلا أنها باهظة الثمن وتخضع للمتطلبات التنظيمية المصاحبة لاستخدام النظائر المشعة. هذه الحواجز تضع استخدام بعض المقايسات بعيدا عن متناول العديد من العمال. ومع ذلك ، على مدار سنوات عديدة ، تم وصف مجموعة متنوعة رائعة من الأساليب الطيفية لقياس هذه الإنزيمات. بشكل عام ، تعتمد هذه الأساليب في نهاية المطاف على قياس إنتاج أو استهلاك NADH / NADPH ، أو توليد مجمعات ملونة بين الجليكوجين واليود. وبالتالي ، فهي واضحة ويمكن تنفيذها باستخدام مقاييس الطيف الضوئي البسيطة المجهزة بمصابيح فلاش التنغستن أو الزينون فقط.
تعتمد المقايسات الطيفية لسينسيز الجليكوجين على قياس ثنائي فوسفات النيوكليوزيد المنطلق من مانح نيوكليوتيدات السكر حيث يضاف الجلوكوز إلى سلسلة الجليكوجينالمتنامية 9,10. الإجراء الخاص بقياس نشاط سينسيز الجليكوجين الموصوف في القسم 1 من البروتوكول ، أدناه ، هو تعديل لذلك الذي حدده Wayllace et al.11 ، ويظهر مخطط الاقتران أدناه:
(الجلوكوز) n + UPD-الجلوكوز → (الجلوكوز) ن + 1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + فوسفوينول بيروفات → بيروفات + ATP
بيروفات + NADH + H + → لاكتات + NAD+
يضيف سينثيز الجليكوجين الجلوكوز من UDP-glucose إلى الجليكوجين. يتم تحويل UDP المتولد في هذه العملية إلى UTP بواسطة كيناز ثنائي فوسفات النوكليوزيد (NDP kinase) ، في تفاعل يولد ADP. يعمل جزيء ADP بدوره كركيزة لكيناز البيروفات، الذي يفسفر جزيء ADP باستخدام فوسفوينول بيروفات كمتبرع بالفوسفات. يتم تحويل البيروفات الناتجة إلى لاكتات بواسطة إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات في تفاعل يستهلك NADH. وبالتالي ، يمكن إجراء الفحص بطريقة مستمرة ، ومراقبة انخفاض الامتصاص عند 340 نانومتر عند استهلاك NADH. يتم تكييفه بسهولة للاستخدام مع الإنزيمات التي تتطلب ADP-glucose كمتبرع بالجلوكوز. هنا ، تكون خطوات الاقتران أبسط لأن ADP الصادر عن عمل سينثيز الجليكوجين يعمل عليه مباشرة بواسطة كيناز البيروفات.
هناك مجموعة متنوعة من المقايسات الطيفية المتاحة لتحديد نشاط فسفوريلاز الجليكوجين. في الإصدار الكلاسيكي ، يتم دفع الإنزيم للخلف ، في اتجاه تخليق الجليكوجين ، كما هو موضح أدناه:
(الجلوكوز) n + الجلوكوز -1-فوسفات → (الجلوكوز) ن + 1 + Pi
على فترات زمنية محددة ، تتم إزالة حصص خليط التفاعل ، ويتم تحديد كمية الفوسفات المحررة12,13. في أيدينا ، كان هذا الفحص ذا فائدة محدودة بسبب وجود فوسفات حر قابل للقياس بسهولة في العديد من المستحضرات التجارية للجلوكوز -1 فوسفات ، جنبا إلى جنب مع التركيزات العالية من الجلوكوز -1 فوسفات اللازمة لعمل الفوسفوريلاز. بدلا من ذلك ، استخدمنا بشكل روتيني مقايسة بديلة تقيس الجلوكوز 1-فوسفات المنطلق عندما يتحلل الجليكوجين بواسطة فسفوريلاز13. يتم استخدام مخطط تفاعل مقترن ، موضح أدناه.
(الجلوكوز) n + Pi → (جلوكوز) n-1 + جلوكوز -1-فوسفات
جلوكوز-1-فوسفات → جلوكوز-6-فوسفات
جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+
يتم تحويل الجلوكوز-1-فوسفات إلى جلوكوز-6-فوسفات بواسطة فوسفوغلوكوموتاز ، ثم يتأكسد الجلوكوز-6-فوسفات إلى 6-فوسفوغلوكونولاكتون ، مع ما يصاحب ذلك من اختزال NADP + إلى NADPH. الإجراء المفصل في القسم 2 من البروتوكول ، أدناه ، مشتق من الطرق التي وصفها Mendicino et al.14 و Schreiber & Bowling15. يمكن إجراء الفحص بسهولة بطريقة مستمرة ، مع زيادة الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد معدل التفاعل.
يعتمد التحديد الطيفي لنشاط إنزيم debranching على قياس الجلوكوز المنبعث من عمل الإنزيم على حد الفوسفوريلاز دكسترين16. يتكون هذا المركب عن طريق معالجة الجليكوجين بشكل شامل مع فسفوريلاز الجليكوجين. نظرا لأن عمل فسفوريلاز الجليكوجين يوقف 4 بقايا جلوكوز بعيدا عن نقطة α1,6 ، فإن الدكسترين الحد يحتوي على الجليكوجين ، وقد تم تقصير السلاسل الخارجية إلى ~ 4 بقايا جلوكوز. يوصف هنا تحضير دكسترين حد الفوسفوريلاز ، باستخدام إجراء مشتق من تلك التي طورها Taylor et al.17 و Makino & Omichi18.
التفكيك هو عملية من خطوتين. ينقل نشاط 4-α-glucanotransferase لإنزيم debranching ثنائي الوظيفة أولا ثلاثة بقايا جلوكوز من نقطة الفرع إلى الطرف غير المختزل لسلسلة جلوكوز α1,4 مرتبطة قريبة. ثم يتم تحلل بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,6 المتبقية عند نقطة الفرع بواسطة نشاط α1,6-glucosidase19. عادة ما يتم إجراء الفحص بطريقة متوقفة ، حيث يتم قياس الجلوكوز المنطلق بعد وقت معين (أو سلسلة من الأوقات) في مقايسة إنزيم مقترنة كما هو موضح أدناه:
(الجلوكوز) ن → (جلوكوز) ن-1 + جلوكوز 
الجلوكوز + ATP → الجلوكوز-6-فوسفات + ADP
جلوكوز-6-فوسفات + NADP+ → 6-فوسفوغلوكونولاكتون + NADPH + H+
يعطي تحديد NADPH المنتج مقياسا لإنتاج الجلوكوز. ويستند الإجراء المبين في القسم 3 من البروتوكول أدناه إلى إجراء وصفه نيلسون وآخرون.16. مثل الطرق الأخرى التي تعتمد على استهلاك أو توليد NADH / NADPH ، فإن الفحص حساس للغاية. ومع ذلك ، فإن وجود الأميليز أو الجلوكوزيداز الأخرى ، والتي يمكن أن تحرر أيضا الجلوكوز الحر من دكسترين حد الفوسفوريلاز ، سوف يسبب تداخلا كبيرا (انظر المناقشة).
يعتمد التحديد اللوني لنشاط الإنزيم المتفرع على حقيقة أن سلاسل الجلوكوز المرتبطة ب α1,4 تتبنى هياكل حلزونية ترتبط باليود ، وتشكل مجمعات ملونة20. يعتمد لون المجمع المتشكل على طول السلاسل المرتبطة α1,4. وبالتالي ، فإن الأميلوز ، الذي يتكون من سلاسل طويلة غير متفرعة إلى حد كبير من الجلوكوز المرتبط ب α1,4 ، يشكل مركبا أزرق عميقا مع اليود. في المقابل ، تشكل الجليكوجينات ، التي تكون سلاسلها الخارجية بشكل عام في حدود 6 إلى 8 بقايا جلوكوز فقط ، مجمعات برتقالية حمراء. إذا تم تحضين محلول الأميلوز بإنزيم متفرع ، فإن إدخال الفروع في الأميلوز يؤدي إلى توليد سلاسل جلوكوز مرتبطة α1,4 أقصر. وبالتالي ، فإن الحد الأقصى لامتصاص مجمعات الأميلوز / اليود يتحول نحو أطوال موجية أقصر. الإجراء الذي تمت مناقشته هنا مشتق من الإجراء المفصل بواسطة Boyer & Preiss21 ويتم تحديد نشاط الإنزيم المتفرع كميا على أنه انخفاض في امتصاص مركب الأميلوز / اليود عند 660 نانومتر بمرور الوقت.
كما ينبغي أن يكون واضحا بسهولة من المناقشة أعلاه ، فإن حقيقة أن ألوان المعقدات التي تشكلت بين سلاسل اليود والجلوكوز α1,4 تختلف باختلاف طول السلسلة تعني أن أطياف الامتصاص لمجمعات الجليكوجين / اليود يجب أن تختلف مع درجة تفرع الجليكوجين. هذا هو الحال بالفعل ، وتمتص الجليكوجينات / الجليكوجينات الأقل تشعبا ذات السلاسل الخارجية الأطول الضوء بطول موجي أطول من الجليكوجينات الأكثر تشعبا / لها سلاسل خارجية أقصر. لذلك يمكن استخدام تفاعل تلطيخ اليود للحصول على بيانات نوعية سريعة عن درجة تفرع الجليكوجين22. يتشكل اللون البرتقالي والبني عندما لا تكون مجمعات الجليكوجين مع اليود شديدة بشكل خاص. ومع ذلك ، يمكن تعزيز تطوير اللون من خلال إدراج محلول كلوريد الكالسيوم المشبع22. هذا يعزز حساسية الطريقة حوالي 10 أضعاف ويسمح بتحليل جاهز لكميات ميكروغرام من الجليكوجين. تم تكييف مقايسة تحديد التفرع الموصوفة في القسم 4 من البروتوكول أدناه من إجراء طوره Krisman22. يتم إجراؤه ببساطة عن طريق الجمع بين عينة الجليكوجين ومحلول اليود وكلوريد الكالسيوم في كوفيت وجمع طيف الامتصاص من 330 نانومتر إلى 800 نانومتر. يتحول الحد الأقصى للامتصاص نحو أطوال موجية أطول مع انخفاض درجة التفرع.
بشكل جماعي ، توفر الطرق الموضحة هنا وسائل بسيطة وموثوقة لتقييم أنشطة الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، وللحصول على بيانات نوعية عن مدى تفرع الجليكوجين.

<table><tbody><tr><td>أميلوبكتين (خالي من الأميلوز) من الذرة الشمعية</td><td>فيشر Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>أميلوز</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP ، ملح ثنائي الصوديوم</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose-1،6-bisphosphate ، ملح البوتاسيوم</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose-6-phosphate ، ملح الصوديوم</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>نازعة هيدروجين الجلوكوز 6 فوسفات ، الدرجة الأولى ، من الخميرة</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen ، النوع الثاني من المحار</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylate cuvettes ، 1.5 مل</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Methacrylate مطلوب لأن بعض الإجراءات هي أجريت عند 340 نانومتر أو أقل</td></tr> <tr><td>من بيتا - نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات ملح الصوديوم</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr> <tr><td>& beta ؛ - نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، ملح ثنائي الصوديوم المنخفض</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoside 5'-diphosphate kinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvate ، ملح</td> <td>أحادي البوتاسيومMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoglucomutase من عضلة الأرانب</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorylase A من عضلة الأرنب</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>إنزيمات بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك من عضلة الأرانب</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glucose ، ملح ثنائي الصوديوم</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

يتم تصنيع الجليكوجين كشكل من أشكال تخزين الجلوكوز بواسطة مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بدءا من البكتيريا إلى الحيوانات. يتكون الجزيء من سلاسل خطية من بقايا الجلوكوز المرتبطة α1,4 مع فروع يتم إدخالها من خلال إضافة روابط α1,6. يتطلب فهم كيفية تنظيم تخليق الجليكوجين وتدهوره وكيف يصل الجليكوجين إلى تركيبته المتفرعة المميزة دراسة إنزيمات تخزين الجليكوجين. ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لدراسة أنشطة الإنزيم هذه تستخدم عادة الكواشف أو التقنيات غير المتاحة لجميع الباحثين. هنا ، نناقش مجموعة من الإجراءات البسيطة تقنيا والفعالة من حيث التكلفة ، ومع ذلك لا تزال قادرة على توفير نظرة ثاقبة قيمة للتحكم في تخزين الجليكوجين. تتطلب التقنيات الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي ، الذي يعمل في نطاق 330 إلى 800 نانومتر ، ويتم وصفها على افتراض أن المستخدمين سيستخدمون مطبات بلاستيكية يمكن التخلص منها. ومع ذلك ، فإن الإجراءات قابلة للتطوير بسهولة ويمكن تعديلها للاستخدام في قارئ الصفائح الدقيقة ، مما يسمح بتحليل متوازي للغاية.

تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين يوضح الشكل 1 نتائج تمثيلية من مقايسات سينثيز الجليكوجين باستخدام إنزيمات منقاة. في اللوحة A ، بعد تأخر طفيف ، كان هناك انخفاض خطي في الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت لمدة حوالي 12 دقيقة. كان معدل التغير في الامتصاص في الشكل 1 أ ~ 0.12 وحدة امتصاص / دقيقة. معدل التغير في الامتصاص بين ~ 0.010 و ~ 0.20 وحدة امتصاص / دقيقة هو الأمثل ويجب تعديل كمية الجليكوجين سينسيز المضافة لمعدلات العائد ضمن هذا النطاق. في اللوحة...

يتم تقديم تقنيات لقياس نشاط الإنزيمات الرئيسية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين ، باستخدام مقياس طيف ضوئي بسيط يعمل في النطاق المرئي.

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

البروتوكولات مهمة ، لأنها تتجنب استخدام النظائر المشعة وتزيل حاجزا قد يمنع العديد من العمال من دراسة إنزيمات استقلاب الجليكوجين. الإجراءات الموصوفة غير مكلفة ، ولا تتطلب سوى الوصول إلى مقياس الطيف الضوئي البسيط. للبدء في تحديد نشاط سينسيز الجليكوجين ، قم بإذابة محاليل المخزون المعدة مسبقا من الجلوكوز UDP و ATP و phosphoenolpyruvate و NDP kinase على الجليد.قبل تسخين حمام مائي إلى 30 درجة مئوية. عندما تكون محاليل المخزون جاهزة ، قم بإعداد خليط فحص كاف وفقا لعدد مقايسات سينسيز الجليكوجين عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب 15 ملليلتر ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير تفاعل فارغ عن طريق استبدال NADH من خليط التفاعل بالماء ، ونقل التفاعل إلى كوفيت ميثاكريلات يمكن التخلص منه.استخدم التفاعل الفارغ لتعيين صفر على مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 340 نانومتر. خذ حصة 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف بالتتابع اثنين ميكرولتر من كل من خليط نازعة هيدروجين كيناز NDP وبيروفات كيناز لاكتات إلى الأنبوب. بعد الخلط ، احتضن الأنبوب برفق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ثلاث دقائق لتسخين خليط التفاعل.ثم أضف 30 ميكرولتر من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين في محلول تريس 20 مليمولار عند درجة الحموضة 7.8 ، واخلطها برفق قبل نقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت للتخلص

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يصف هذا الفيديو مقايسة الطيف الضوئي لتقدير نشاط سينسيز الجليكوجين. تعتمد الطريقة على تقليل امتصاص NADH بمرور الوقت وتشير إلى نشاط سينسيز الجليكوجين.

الفحص الطيفي لتحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

في هذا الفيديو ، نصف مقايسة القياس الطيفي النوعي لتحديد مدى التفرع في عينة الجليكوجين ذات البنية غير المميزة. تشير مقارنة الحد الأقصى للامتصاص للعينة غير المميزة بالسكريات ذات الهياكل المتفرعة المعروفة إلى وجود تفرع في العينة غير المميزة.

مقايسة تفرع الجليكوجين لقياس درجة تفرع الجليكوجين

نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.

المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين<em&gt; في المختبر</em

تلطيخ شيف الحمضي الدوري هو تقنية تصور محتوى السكريات في الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول تلطيخ شيف الحمضي الدوري الذي تم تكييفه للاستخدام في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المنقاة من الدم الوريدي البشري. يتم إثراء هذه العينات للخلايا الليمفاوية وخلايا الدم البيضاء الأخرى في الجهاز المناعي.

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

هنا، نقدم مقايسة موثوقة وسهلة لقياس محتوى الجليكوجين في الخلايا السيانوباكتريال. الإجراء ينطوي على هطول الأمطار، اختيار البلمرة، والكشف عن بقايا الجلوكوز. هذا الأسلوب هو مناسبة لكل من ويلديب والسلالات المعدلة وراثيا ويمكن أن تسهل الهندسة الأيضية من البكتيريا الزرقاء.

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

تم تحديد تركيز السكروز الأمثل لاستخراج الجليكوجين في الكبد باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. أثبتت إضافة خطوة الغليان لمدة 10 دقائق لتثبيط إنزيمات تحلل الجليكوجين أنها مفيدة.

استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين

يزيد إجراء ما بعد التثبيت المعدل من تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. توفر هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يصف كيفية التعامل مع الأنسجة وإجراء التصوير واستخدام الأساليب المجسمة للحصول على بيانات كمية وغير متحيزة حول توزيع الجليكوجين تحت الخلوي الخاص بنوع الألياف في العضلات الهيكلية.

القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

يستخدم فحص الأنسجة الحيوانية الكشف عن التلألؤ النووي لتحديد النشاط الأنزيمي لسينسيز الجليكوجين عن طريق قياس دمج الجلوكوز المسمى راديو في الجليكوجين.

التقييم الكيميائي الإشعاعي لنشاط إنزيم سينسيز الجليكوجين في الأنسجة الحيوانية

نصف هنا طريقة جديدة وقوية وفعالة لتنقية التقارب الترادفي (TAP) للتعبير عن مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة وعزلها وتوصيفها. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوصيف الكيميائي الحيوي للمجمعات المنفصلة بالإضافة إلى تحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم وظيفتها.

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

يصف لنا استخراج معدلة على نطاق ضيق وفحوصات اللونية لاكتات وبيروفات في ديدان أسطوانية C. ايليجانس. عند استخدام أدوات التحليل التجاري، المهم التطور التقني الحساسية والدقة. ترسيب البروتين في استخراج هي الخطوة الأكثر أهمية لتحديد الكمية من نواتج الأيض داخل الخلايا.

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

تعلم طرق قياس نشاط إنزيمات استقلاب الجليكوجين باستخدام المطياف الضوئي البسيط. هذه التقنيات غير مشعة ومنخفضة التكلفة وتتيح للباحثين دراسة عمليات التمثيل الغذائي بأمان ودقة عالية.

الطرق الطيفية لدراسة استقلاب الجليكوجين حقيقي النواة

استكشف المزيد من الفيديوهات