الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ في الجسم الحي

Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة ديناميكيات الخلايا العصبية والدوائر الدقيقة في الفئران التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول إجراء جراحات الدماغ لتحقيق تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي باستخدام منظار مصغر.

يمكن التصوير المصغر للكالسيوم في الجسم الحي الباحثين من فحص النشاط المنسق مكانيا وزمنيا من مئات الخلايا العصبية في هياكل الدماغ العميقة للحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي العديد من المزايا ، بما في ذلك القدرة على إجراء تسجيلات خاصة بنوع الخلية وواسعة النطاق وطولية. يتوافق بروتوكول الجراحة الخاص بنا للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN مع أي فوتون واحد تجاري أو مخصص ونظامين لتصوير الفوتون للدماغ العميق في الجسم الحي لتصوير الكالسيوم.

سيوضح الإجراء راشمي ثابا ، طالب دراسات عليا من مختبري. بعد تطهير المنطقة الجراحية المحلوقة للفأر المخدر ، استخدم مشرطا لإجراء شق بسنتيمترين عبر الجلد على طول خط الوسط لفضح لامدا وبريجما الجمجمة. بعد تحديد موقع نتوء حفر الأسنان 0.5 ملم إلى موضع من الأمام الخلفي 1.94 ملم والجانبي الإنسي 0.5 ملم من bregma ، ابدأ الحفر من خلال الجمجمة.

بعد ذلك ، قم بتحميل الفيروس في حقنة الميكرولتر باستخدام لوحة التحكم في المضخة الصغيرة واسحب 500 نانولتر من فقاعة الهواء متبوعة ب 800 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر في الثانية. حرك الإبرة ببطء إلى أسفل في أنسجة المخ إلى إحداثيات Z المستهدفة للظهرية البطنية 1.75 ملم ثم حركها قليلا إلى إحداثيات Z البطنية الظهرية 1.65 ملم. على لوحة التحكم ، اضبط المضخة الصغيرة على حقن 500 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر في الدقيقة قبل الضغط على زر التشغيل لحقن الفيروس.

عندما ينتهي الحقن ، اصطف حواف الجلد وأغلق الشق بعناية باستخدام خياطة 4-0. ضع مرهم مضاد حيوي على المنطقة المخيطة لمنع العدوى. لزرع مؤشر التدرج أو عدسة GRIN ، قم باستئصال منطقة مثلثة من الجلد يبلغ ارتفاعها 1.5 سم وقاعدة 1.5 سم من الجانب الأمامي بين العينين إلى الجانب الخلفي خلف لامدا باستخدام مقص دقيق.

بعد تنظيف الجمجمة وتجفيفها تماما ، ضع سيانواكريليت على حواف الجلد وقم بتوصيل الجلد بالجمجمة. بعد خمس دقائق عندما يجف سيانو أكريليت ، حدد موقع نتوء حفر الأسنان بقطر 1.2 ملم إلى موضع أمامي خلفي 1.94 ملم ، جانبي إنسي على بعد 0.8 ملم من البريما. حفر من خلال الجمجمة، تليها إزالة الجافية باستخدام طرف إبرة قياس 30.

نظف جميع قطع حطام العظام باستخدام ملقط حاد بزاوية 45 درجة. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة نهاية حادة مصقولة يدويا بمقياس 27 بحامل الإبرة إلى جانب ذراع روبوتية مائلة بزاوية 10 درجات وقم بتوصيل الطرف الآخر من حامل الإبرة بنظام تفريغ المنزل. حدد موقع طرف الإبرة لمجرد لمس البريجما قبل النقر على زر بريجما لضبط إحداثيات Z للبريجما على الصفر.

اضبط قيمة الإدخال X على 0.8 ، وقيمة الإدخال Y على 1.94 ، وقيمة إدخال Z على 1.0 وانقر فوق الزر Find لتحريك الإبرة إلى الجزء العلوي من الحفرة المحفورة في الجمجمة. قم بتوسيط طرف الإبرة إلى الحفرة المحفورة وقم بإنزالها إلى الموضع Z صفر. قم بتشغيل الفراغ وابدأ في شطف منطقة الدماغ المكشوفة بالسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي ، أو ACSF ، من خلال نظام أنابيب يتم التحكم فيه بالجاذبية متصل بإبرة قياس 30 بطرف منحني.

يتم فقاعات ACSF باستمرار بمزيج غاز من 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء ترشيحه من خلال مرشح 0.2 ميكرون. باستخدام برنامج AutoStereota ، سيكتمل طموح أنسجة المخ في أربع جولات. بالنسبة للجولة الأولى من الطموح، تأكد من أن قيمة Z تعرض صفرا.

ثم في جلسة zStep ، انقر فوق الصفين الأول والثاني وتحقق منهما. قم بتعيين قيم الصف الأول إلى 0.2 و 1. اضبط قيم الصف الثاني على 0.15 و4.

في جلسة الوضع ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 1.2. تعيين التعتيم 0.9. ستكون جميع القيم الأخرى افتراضية.

لبدء الطموح ، انقر بالتتابع على أزرار NotSet و KeepZero و Start. تولد الجولة الأولى من الشفط جيبا عموديا بعمق 0.8 ملم وقطر 1 ملم. في الجولة الثالثة من الطموح ، انقر فوق الصف الأول وتحقق منه لجلسة zStep وقم بتعيين قيم الصف الأول إلى 1.8 و 1.

في جلسة الوضع ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2. ابدأ الطموح من خلال الحفاظ على القيم الأخرى كما كانت في الجولة السابقة. بعد الجولة الثالثة من الطموح ، يبلغ عمق جيب العمود 1.8 ملم.

الجولة الأخيرة من الطموح هي تنظيف الدم المتراكم في أسفل الجيب. اضبط قيم الصف الأول على 1.6 و 1 في جلسة zStep واضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2 و Dims 0.6 في جلسة الوضع قبل بدء الطموح. بمجرد أن يصبح الجيب خاليا من الدم ، أوقف الفراغ ، وتوقف عن ري ACSF ، وارفع الإبرة بمقدار 2 ملم في إحداثيات Z و 0.5 ملم أمامية للمركز.

ضع عدسة GRIN المعقمة مقاس 1 ملليمتر في جيب أنسجة المخ. بعد ذلك ، ضع الأغاروز المذاب في الفجوة بين عدسة GRIN وأنسجة المخ بمساعدة ملعقة. بعد أن يشكل الأغاروز هلام ، قم بإزالة الأغاروز الزائد باستخدام شفرة صغيرة.

امزج مسحوق أسمنت الأسنان وسائل التحفيز في خلط مبرد مسبقا جيدا وقم بتطبيق طبقة من الأسمنت الراتنجي اللاصق ذاتي المعالجة على الجمجمة ، بدءا من إحاطة عدسة GRIN ثم تغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل. في بئر بلاستيكية نظيفة ، اخلطي مسحوق أسمنت الأسنان والفحم الأسود مع السائل لتطبيق طبقة رقيقة من الخليط فوق الطبقة الأولى من أسمنت الأسنان. اتركه يتصلب لمدة خمس دقائق.

قم بتوصيل Miniscope بالكابل وقم بتشغيل برنامج NuView المطور خصيصا. في NuView، انقر فوق الأجهزة، وتحقق من LED1 وانقر فوق الزر بث لعرض الصور الحية. لإيقاف البث المباشر، انقر على الزر إيقاف.

بعد ذلك ، قم بتسوية Miniscope في ذراع Miniscope مخصص للإمساك. بمساعدة وحدات التحكم الآلية ، حدد موقع Miniscope فوق عدسة GRIN المكشوفة مباشرة ، مما يجعله موازيا لسطح العدسة. قم بإسقاط Miniscope ببطء نحو عدسة GRIN واضبط موضع Z حتى يتم العثور على أفضل مستوى للتركيز البؤري.

ضع الطبقة الأولى من أسمنت الأسنان حول قاعدة Miniscope دون تغيير موضع Miniscope. بعد تصلب الأسمنت ، قم بإزالة ذراع الإمساك برفق بحيث يمكن ل Miniscope الوقوف بمفرده على رأس الماوس. ضع طبقة ثانية من أسمنت الأسنان حول القاعدة لملء جميع الفجوات ، مما يضمن عدم وجود تسرب لضوء LED من الفجوات.

دع أسمنت الأسنان يصلب. بعد تخدير الماوس لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران ، قم بفك برغي القفل في القاعدة باستخدام مفك براغي صغير قبل إزالة الغطاء الواقي وتنظيف سطح عدسة GRIN باستخدام قطعة قطن منقوعة بالأسيتون. قم بتوصيل Miniscope بالكابل وابدأ تشغيل برنامج NuView لبدء تحديد أفضل مستوى بؤري مع ضبط موضع Miniscope بالنسبة للقاعدة عن طريق التشديد أو التخفيف قليلا بمساعدة ملقط حاد.

بمجرد تحديد أفضل مستوى بؤري ، قم بتشديد برغي القفل قبل فصل الكابل ووضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي. قم بتشغيل برنامج كاميرا السلوك لعرض ساحة سلوك الماوس من خلال وظيفة البث المباشر. اضبط تركيز الكاميرا العلوية يدويا.

حدد Trigger Strobe وحدد تمكين / تعطيل المشغل ، متبوعا بالنقر فوق الزر تسجيل. ثم استخدم استعراض لتحديد موقع حيث سيتم حفظ تسجيلات السلوك. حدد تنسيق الصورة المطلوب.

اجعل الماوس قريبا من الساحة وقم بتوصيل Miniscope بالكابل المرتبط بنظام الحصول على البيانات. ثم ضع الماوس في وسط الساحة. في برنامج كاميرا السلوك، انقر فوق بدء التسجيل.

في NuView ، تحقق من LED1 ، وانقر فوق التقاط ثم قم بتشغيل الأزرار لبدء التسجيل. هذا يسمح بالتسجيلات المتزامنة لتصوير الكالسيوم وسلوك الماوس. اضغط على إيقاف بعد 3،000 إطار وحفظ الملفات.

عند الانتهاء من التسجيل ، قم بتخدير الماوس لفترة وجيزة باستخدام الأيزوفلوران ، وافصل Miniscope عن القاعدة وضع الغطاء الواقي فوق القاعدة قبل وضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي. احتوت خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم دون المستوى الأمثل في الجسم الحي على بعض الخلايا العصبية النشطة ، في حين أن التصوير الناجح شمل عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة في المنطقة المركزة. في المثال النموذجي لتصوير الكالسيوم غير الناجح في الجسم الحي ، لوحظ أن المنطقة مظلمة وتحتوي على أقل من خمس خلايا عصبية نشطة ، أو كانت المنطقة مشرقة ولكن لم يكن لديها خلايا عصبية نشطة.

في التحليل التمثيلي ، يتم عرض خريطة الخلايا الفلورية القصوى للإسقاط وانتقالات الكالسيوم من تسجيل تصوير الكالسيوم المتتالي في الجسم الحي. أشار تقييم ما بعد الوفاة لتعبير GCaMP6f وزرع عدسة GRIN في PFC الإنسي لفأر تجريبي إلى أنه تم التعبير عن GCaMP6f وتم زرع عدسة GRIN بدقة في منطقة الدماغ المطلوبة. للحصول على تصوير جيد للكالسيوم ، من الضروري التأكد من توقف النزيف تماما وأن المجال خال من جلطات الدم قبل زرع عدسة GRIN.

يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة تغيرات الدائرة العصبية في نموذج الفأر لاضطرابات الدماغ البشرية المختلفة واختبار ما إذا كان مرشح الدواء يمكنه تطبيع الدوائر المتغيرة.