تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لاكتشاف وتوصيف الارتباطات الذاتية للبروتينات المضطربة جوهريا
سبتمبر 23, 2021
يتم تقديم بروتوكول لتطبيق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي للكشف عن التفاعلات الضعيفة والعابرة بين الجزيئات وداخلها في البروتينات المضطربة جوهريا.
يمكن استخدام تقنية تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لتوصيف وقياس المسافات بين الجزيئات وتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية العابرة و / أو منخفضة السكان. هنا ، طبقنا هذه التقنية لالتقاط التفاعلات التي تسبق تكثيف البروتين. تتيح حساسية PREs تحديد الدقة الذرية والكشف والقياس الكمي للحالة الديناميكية التي تظل غير مرئية ولا يمكن الوصول إليها لتقنيات الرنين المغناطيسي النووي الأخرى.
تتضمن الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول إزالة ملصق دوران النيتروكسيد غير المقترن وتحليل الأطياف بعناية لقياس ارتفاع الذروة بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر أثناء إعداد تجربة الرنين المغناطيسي النووي ومعايرة النبض. للبدء ، أضف 3-maleimido-PROXYL من محلول مخزون عند 20 مرة زيادة مولية من البروتين المسمى نظائريا 15N محل الاهتمام.
احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية محمية من الضوء والأكسجين ومع هزاز لطيف أو nutation. في اليوم التالي ، قم بإزالة ملصق الدوران الحر غير المتفاعل لمنع المذيب غير المحدد PRE باستخدام إما غسيل الكلى الشامل لعينة البروتين أو باستخدام ترشيح الهلام. ثم استخدم كاشف إيلمان لتحديد مجموعات سلفهيدريل الحرة في المحلول.
قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم ببناء المنحنى القياسي. لقياس PRE، قم بإعداد بروتين 15N المخصب بالنظائر المسمى بتركيز لا يقل عن 100 ميكرومولار ، ولكن ليس أكثر من 300 ميكرومولار ، في مخزن مؤقت مناسب للرنين المغناطيسي النووي. ثم باستخدام ماصة زجاجية طويلة الساق أو ماصة دقيقة ، انقل عينة الرنين المغناطيسي النووي إلى أنبوب NMR بخمسة ملليمترات مناسب للاستخدام في المغناطيسات عالية المجال.
ضع العينة في المغناطيس. قفل على إشارة الديوتيريوم باستخدام أمر القفل وتناغم ومطابقة قناة البروتون وفقا لبروتوكولات المنشأة. ثم اضبط الحشوات باستخدام الروتين الفرعي العلوي للرقاقة لتحسين قمع إشارة المذيبات.
بعد ذلك ، قم بمعايرة نبضة البروتون باستخدام برنامج P-OPT. ثم قم بمعايرة نبضة 15N مقابل عينة قياسية. حدد التوهين الصحيح لنبضات الشكل باستخدام الروتين الفرعي لأداة الشكل.
ثم افتح ملف شكل النبض المناسب بالنقر فوق رمز المجلد. تم العثور على النبضات المشكلة في قسم معلمات النبض لمعلمات الاستحواذ. بعد تحميل ملف تعريف النبض ، انقر فوق تحليل الشكل الموجي ، متبوعا بدمج الشكل.
أدخل النبضة الصلبة للبروتون المعاير 90 درجة ، وطول نبضة الشكل المطلوب ، والدوران. ثم احسب مستوى طاقة النبضة المشكلة عن طريق إضافة تغيير مستوى الطاقة إلى التوهين للنبضة المعايرة 90 درجة. سجل بروتون قياسي 15N HSQC لتحسين عرض المسح وتردد الموجة الحاملة والتحقق من قمع المياه.
أخيرا، اضبط عرض الاجتياح وعدد زيادات الأبعاد غير المباشرة باستخدام أوامر SW وTD أو مباشرة في شاشات التشغيل المناسبة. معايرة النبضات المشكلة كما هو موضح سابقا. ثم أدخل أطوال النبضات المعايرة في قسم معلمات النبض في علامة التبويب معلمات الاكتساب.
لقياس بروتون الأميد T2 باستخدام نهج نقطتي تأخير زمنيتين ، اضبط التأخيرات الزمنية عن طريق تحرير ملف قائمة VD. يتم ضبط التأخير الأول على 0.01 مللي ثانية. باستخدام العلاقة إلى الحد الأقصى المتوقع ل PRE، اختر التأخير الثاني.
ثم حدد قيمة مناسبة من خلال مقارنة الزيادات الأولى من أطياف التأخير الأول والثاني وضبط التأخير الثاني بحيث تضمحل الإشارة إلى ما بين 40 إلى 50٪ من قيمتها الأولية. حدد عدد النقاط المعقدة المراد تسجيلها وعدد عمليات المسح للحصول على متوسط إشارة كاف. ثم استخدم الأمر EXPT لحساب وقت التجربة وبدء التجربة باستخدام الأمر ZG. بعد إذابة أسكوربات الصوديوم في المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمطابقة المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي الأصلي.
ثم أضف حمض الأسكوربيك إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي عند زيادة مولية 10 مرات فوق تركيز ملصق الدوران عن طريق وضع قطرة أسفل حافة الأنبوب. قم بتغطية الأنبوب واقلبه بعناية للخلط. تدور عند 200 إلى 400 جم لمدة 10 إلى 20 ثانية في جهاز طرد مركزي يدوي لتسوية العينة في قاع الأنبوب.
بعد لف الأنبوب بورق ، اترك التفاعل يستمر لمدة ثلاث ساعات على الأقل. ثم سجل أميد بروتون T2 على العينة المغناطيسية باستخدام نفس المعلمات المستخدمة للعينة البارامغناطيسية. تم تسجيل أميد بروتون جاما داخل الجزيئات على جزء مضطرب جوهريا مرتبط ذاتيا مشتق من مجال التعقيد المنخفض لبروتين ربط الحمض النووي الريبي EWSR1.
من المتوقع أن يتم توسيع المخلفات القريبة من نقطة ربط ملصق الدوران بشكل كبير ولا يمكن اكتشافها في الطيف. كانت البقايا التي كانت متباعدة بالتتابع من نقطة التعلق ولكنها أظهرت جاما محسنة قريبة مكانيا من ملصق الدوران. في حالة البروتينات المضطربة جوهريا ، فإن تسجيل وتحليل الهريس سينتج عنه معلومات حول الاتصالات داخل الجزيئات وأسطح التفاعل العابرة.
يمكن أن يوفر الجمع بين قياسات PRE والطرق الفيزيائية الحيوية الأخرى مثل تشتت الضوء الديناميكي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والطرد المركزي الفائق التحليلي ، والطرق الحسابية رؤى أعمق. يساعد قياس PRE في توصيف الحالة العابرة ذات الكثافة السكانية المنخفضة. يمكن توسيع هذا النهج لتوصيف التفاعلات المهمة لعدد لا يحصى من العمليات البيولوجية مثل التعرف الجزيئي ، والانتقاء التوافقي الخيفي ، وعمليات التجميع بما في ذلك تجميع العضيات الخالية من الأغشية عن طريق فصل الطور.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لاستخدام تحسين الاسترخاء البارامغناطيسي (PRE) لقياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي لاكتشاف التفاعلات الضعيفة والعابرة في البروتينات غير المرتبة بشكل متأصل. تسمح التقنية بتمييز المسافات بين الجزيئات وتقدير التفاعلات الحيوية الجزيئية ذات السكان المنخفضة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- علم الأحياء البنيوي
الخلفية
- إن تحسين الاسترخاء البارامغناطيسي هو تقنية قوية لقياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي.
- يمكنها تحديد الحالات الديناميكية التي غالبًا ما تكون غير متاحة للطرق الأخرى.
- فهم تفاعلات البروتينات أمر بالغ الأهمية لتوضيح العمليات البيولوجية.
- تلعب البروتينات غير المرتبة بشكل متأصل أدوارًا مهمة في وظائف الخلايا.
هدف الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل لتطبيق قياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي لتحسين الاسترخاء البارامغناطيسي.
- التقاط التفاعلات التي تحدث قبل تكاثف البروتين.
- تعزيز حساسية ودقة قياسات قياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي.
الطرق المستخدمة
- استخدام ملصق الدوران 3-maleimido-PROXYL.
- تحضير محلول أساسي بزيادة مولارية 20 مرة.
- تحليل دقيق لأطياف قياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي لقياس ارتفاعات القمم.
- الاهتمام بإعداد تجربة قياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي ومعايرة النبضة.
النتائج الرئيسية
- اكتشاف ناجح للتفاعلات البروتينية العابرة.
- تحديد الحالات الديناميكية بدقة ذرية.
- تقدير التفاعلات الحيوية الجزيئية التي تكون غير مرئية بخلاف ذلك.
- تبيان حساسية التقنية في التقاط التفاعلات الضعيفة.
الاستنتاجات
- إن قياس الطيف الرنين النووي المغناطيسي لتحسين الاسترخاء البارامغناطيسي فعال لدراسة البروتينات غير المرتبة بشكل متأصل.
- يعزز البروتوكول فهمنا لديناميكيات البروتين.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى التفاعلات الحيوية الجزيئية المختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Paramagnetic relaxation enhancement (PRE) NMR enables detection and quantification of weak, transient biomolecular interactions that are invisible to conventional structural methods. This capability supports target validation by characterizing low-population encounter complexes in intrinsically disordered proteins, which are increasingly recognized as therapeutic targets. The technique provides atomic-resolution insights into dynamic states relevant to molecular recognition and phase separation processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by detecting transient protein-protein or protein-nucleic acid interactions.
- Operational Value: Enables functional target validation through measurement of intermolecular distances in dynamic systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by characterizing interaction surfaces that drive promiscuous binding in disordered regions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining interaction interfaces.
- Quantitative Output: Delivers distance constraints and population estimates for sparsely populated states.
- Reproducibility: Requires careful spin-label removal and peak-height analysis to ensure reliable measurements.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to biomolecular condensates and membraneless organelle formation via phase separation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by characterizing interaction thermodynamics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific aggregation.
Pipeline & Workflow Integration
PRE NMR fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for disordered protein targets where traditional structural methods fail.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting encounter complexes prior to stable complex formation.
- Screening: Enables assay standardization through quantifiable PRE effects on amide proton T2 relaxation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (PRE rates, distance estimates) for comparing binding conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by characterizing interactions relevant to assembly processes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing weak interactions across multiple disordered protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through detection of transient, low-affinity interactions.
- Operational Value: Standardization via controlled spin-label conjugation and diamagnetic/paramagnetic sample comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in disordered protein systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on interaction strength and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy and spin-label chemistry.
- Needs high-field NMR instrumentation with pulse calibration capabilities.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Must account for protein-specific factors affecting spin-label accessibility and relaxation.
- Limited to systems where spin labeling does not perturb native interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Conjugating the 3-Maleimido-PROXYL Nitroxide Spin Label
1:38
Preparing the NMR Sample for Measuring Intramolecular PRE
2:11
Setting Up the NMR Spectrometer and Experiment Specific Parameters
3:51
Setting Up the 1HN-T2 Experiment
4:58
Making a Diamagnetic Sample by Reducing Spin-Label with Ascorbic Acid
5:52
Results: 1HN-T2 Rates for Residues 171 - 264 of the Intrinsically Disordered Domain of EWSR1
6:30
Conclusion
![قياس الاسترخاء تدور شعرية الاعتماد المجال المغناطيسي من فرط الاستقطاب [1-13C] بيروفات](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.672Z&w=384&q=75)
