خوارزمية تحليل الصور القائمة على المنطقة لتحديد كمية البلاعم والخلايا الليفية المشتركة
فبراير 15, 2022
نقدم طريقة تستخدم نهجا قابلا للتعميم لتحليل الصور القائم على المنطقة لتحديد عدد الخلايا. استغل تحليل مجموعات الخلايا المختلفة ارتفاع الخلية الكبير والاختلافات الهيكلية بين أنواع الخلايا المتميزة داخل خوارزمية تكيفية.
يمكن استخدام هذه الطريقة لمساعدة الباحثين على تحليل وإحصاء الثقافات المشتركة للخلايا باستخدام تحليل بسيط وفعال قائم على المنطقة. هذه التقنية سهلة التنفيذ نسبيا باستخدام البرامج المتاحة على نطاق واسع وتوفر وسيلة موثوقة ودقيقة لتحديد أنواع الخلايا المختلفة داخل بيئة الزراعة المشتركة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول كيفية تآزر الثقافات المشتركة المحددة للخلايا للمساعدة في تجديد الأنسجة.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للتحقق من صحة دراسات المؤشرات الحيوية أحادية الزراعة. للبدء ، استزراع 264.7 بلاعم خام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتصوير الزراعة الأحادية في ملليلتر واحد من DMEM مكملة ب FBS و penicillin-streptomycin و bicarbonate الصوديوم و beta-mercaptoethanol في قارورة زراعة خلايا سعة خمسة ملليلتر بكثافة 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. زراعة خلايا NIH / 3T3 في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين الستربتومايسين.
بالنسبة للتصوير بالزراعة المشتركة ، فإن زراعة البلاعم الخام 264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3 باستخدام وسط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على جزء واحد خام 264.7 وسط وجزء واحد من NIH / 3T3 وسط معا بنسب مختلفة وكثافة إجمالية تبلغ 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. بعد البذر ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للوصول إلى كثافة خلية قابلة للحياة تبلغ 80٪ من التقاء الخلايا. للحصول على صور الخلايا باستخدام مجهر مقلوب مجهز بهدف 40X ، حدد قدرة الخوارزمية على تقييم الصور بدقة مع مجموعة من صفات الصورة.
احصل على صور بمقياس رمادي مع بؤر مختلفة تنتج صورا غير مصابة وبصلة وتصديرها في ملف czi الخام. للحصول على صور للخلايا باستخدام الطريقة المستندة إلى منطقة، انسخ ملف الصورة والصقه لتحليله في سلة المهملات وأدخل اسم الملف عن طريق تنفيذ الأمر. اضغط على تشغيل لبدء تشغيل البرنامج.
قم بتحليل الصور عن طريق الفتح عن طريق إعادة الإعمار ، يليه الإغلاق عن طريق إعادة الإعمار باستخدام وظائف المصدر لتكبير المقدمة من الخلفية عن طريق تنفيذ الأمر المعني. لربط الصور المعاد بناؤها باستخدام نظام تعريف قائم على النسبة المئوية ، قم بتمييز الخلايا عن الخلفية باستخدام فرق مئوي عن الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة مع أكبر قيمة بكسل تضم 0.5٪ على الأقل من صورة معينة. تحليل وتقييم قيم البكسل للبلاعم الخام 264.7 ، مما يضمن أن القيم في حدود 4.5٪ من الحد الأقصى للبكسل ذي الصلة.
ثم ضع علامة على البيكسل كخلوي. بالنسبة للصور التي تحتوي على ملفات تعريف خلايا البصلصال ، قم بتنفيذ إجراء تكراري لتصحيح الثنائيات الخاطئة في مراكز الخلايا. حدد تخمينا أوليا لتغطية الخلية الإجمالية.
قم بتشغيل الخوارزمية وتحليل الصور باستخدام التقديرات الأولية لألفا وكابا لملء جزء من الجزر. ثم استخدم عدد الخلايا والتغطية بعد التحليل لإعادة حساب kappa. لتحديد متوسط مساحة الخلية بعد ثنائية الصورة، احصل على متجه لجميع مواقع المركز ونصف قطر الدوائر الموجودة داخل الصورة عن طريق تنفيذ الأمر.
استخدم مخرجات نصف القطر لحساب متوسط مساحة الخلية عن طريق حساب المتوسط وتحليل 10 خلايا على الأقل لضمان تحديد المنطقة بدقة. قم بإجراء تحليل الصورة باستخدام الأوامر كما هو موضح سابقا. ثم قم بإجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على خلايا 264.7 و NIH / 3T3 الخام عن طريق تحديد معلمة phi تجريبيا باستخدام صور لخلايا 264.7 الخام و NIH / 3T3.
خمن قيمة phi الأولية وكرر حتى يتطابق عدد الخلايا وتغطيتها بشكل وثيق مع الأعداد اليدوية الخاصة بالثقافة المشتركة الخام 264.7 و NIH / 3T3. حدد عدد الخلايا الخام 264.7 في إجمالي تغطية الخلايا كما هو موضح سابقا لصور الزراعة الأحادية. قم بتحليل الصورة المحولة إلى مستجمعات المياه مرة أخرى بدون معلمة phi ، واكتشاف كل من البلاعم والخلايا الليفية.
احصل على بيانات الخلايا الليفية NIH/3T3 عن طريق طرح 264.7 بكسل خلية خام تم الحصول عليها بشكل انتقائي باستخدام طرق العتبة القياسية والقياس الكمي القائم على المساحة الموضحة سابقا. تم إجراء تحليل للبلاعم الخام غير البصيلة 264.7 وتم تسجيل مخرجات الخوارزمية. أحصت حسابات متوسط مساحة الصورة باستخدام خوارزمية 226 خلية ، في حين حدد العد اليدوي 241 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 6٪ تم أيضا إجراء تحليل للبلاعم الخام 264.7.
أحصت حسابات متوسط مساحة الصورة باستخدام خوارزمية 221 خلية ، تم التحقق منها من خلال إحصاء يدوي ل 252 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 12٪ تم إجراء تحليل للمزارع المشتركة التي تحتوي على كل من البلاعم الخام 264.7 والخلايا الليفية NIH / 3T3. كانت مخرجات الخوارزمية لعدد البلاعم الخام 264.7 137 ، في حين حدد العد اليدوي 155 خلية بقيمة خطأ تقريبية تبلغ 11٪ لتحديد متانة خوارزمية عد الخلايا ، تم حساب خمس صور بلاعم 264.7 خام عن طريق التعرف التلقائي على الخلايا وعدد المستخدمين اليدوي. تم الحصول على معامل النرد بمتوسط معلمة 0.85 عبر خمس صور.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي استخدام المعلمات القائمة على النسبة المئوية والتي تسمح بالكشف القوي عن الخلايا في كل من صور الزراعة الأحادية والصور ذات الزراعة المشتركة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الخلايا ذات الأهمية لمزيد من التحليل باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية لتقييم المؤشرات الحيوية التي تحدد مجموعات خلايا معينة وتطوير المؤشرات الحيوية في أنظمة الزراعة المشتركة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحليل وإحصاء الحضانات المشتركة للخلايا باستخدام نهج تحليل الصور المستند إلى المنطقة. تم تصميم هذه التقنية لتكون بسيطة وفعالة، وتوفر تعريفًا موثوقًا لأنواع الخلايا المختلفة ضمن بيئة الحضانة المشتركة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- تحليل الصور
- تجديد الأنسجة
الخلفية
- يمكن أن توفر الحضانات المشتركة للخلايا نظرة ثاقبة للتفاعلات الخلوية.
- تظهر أنواع الخلايا المختلفة اختلافات هيكلية كبيرة.
- يعد إحصاء الخلايا الدقيق أمرًا بالغ الأهمية لفهم ديناميكيات الحضانة المشتركة.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى الموثوقية أو سهولة التطبيق.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لإحصاء الخلايا الفعال في الحضانات المشتركة.
- تعزيز فهم كيفية تآزر أنواع الخلايا المحددة.
- التحقق من صحة دراسات المؤشرات الحيوية للحضانة المفردة.
الطرق المستخدمة
- استخدام تحليل الصور المستند إلى المنطقة لتعريف الخلايا.
- زراعة الخلايا البلعمية الخام 264.7 وخلايا NIH/3T3.
- تنفيذ خوارزمية تكيفية للتحليل.
- استخدام برامج متاحة على نطاق واسع لسهولة التطبيق.
النتائج الرئيسية
- توفر الطريقة إحصاءات خلوية موثوقة ودقيقة.
- تستطيع بشكل فعال التمييز بين أنواع الخلايا المختلفة.
- اكتسبت رؤى حول آليات تجديد الأنسجة.
- تحققت صحة دراسات الحضانة المفردة.
الاستنتاجات
- تعد طريقة التحليل المستندة إلى المنطقة أداة قيمة للباحثين.
- تبسط عملية تحليل الحضانات المشتركة.
- يمكن أن تعزز التقنية الدراسات في بيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of heterogeneous cell populations is critical for de-risking target validation in tissue regeneration and fibrosis research. This area-based image analysis algorithm enables reliable distinction and counting of macrophage-fibroblast cocultures, supporting mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular interaction studies. The method provides predictive confidence in early discovery by delivering quantitative, reproducible readouts essential for go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying macrophage and fibroblast contributions in coculture systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible, error-bounded cell counting (<10% error margin) in complex co-culture environments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative data on cell-type-specific responses to modulators or genetic perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness in high-density seeding conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via percentile-based thresholding and iterative correction for non-ideal cell morphologies.
- Scalability: Enables platform reuse across varying coculture ratios and image qualities using widely available MATLAB-based tools.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling analysis of cocultures central to tissue regeneration pathways.
- Mechanistic De-risking: Isolates fibroblast and macrophage contributions via selective exclusion algorithms, clarifying pathway-specific effects.
- Preclinical Readiness: Provides validated cell counts that inform biomarker assessment and molecular analysis of specific populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for quantifying stromal-immune interactions in fibrosis and wound healing models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate phenotyping of macrophage-fibroblast cocultures.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in coculture systems.
- Analytics: Generates measurements (cell counts, coverage, area) that allow teams to compare conditions and assess biological responses.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by enabling analysis of cocultures in tissue regeneration contexts.
- Enterprise Reuse: Frameworks the method as a scalable, standardized tool applicable across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in coculture systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across varying image qualities and cell densities.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in fibrosis and regeneration programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, reproducible coculture phenotyping data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in image analysis and MATLAB programming for algorithm implementation and parameter tuning.
- Dependent on inverted microscopy with 40X objective and grayscale image acquisition capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols (focus, lighting, file format) for consistent algorithm performance.
- Requires adaptation of parameters (phi, alpha, kappa) when applied to different cell types or coculture ratios.
- Practical limitation: Algorithm accuracy depends on sufficient height differences between cell types for effective segmentation.
