تحسين قابلية التكرار لتلبية الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية إرشادات 2018 في تحليل تتبع الجسيمات النانوية

تم تطوير هذا البروتوكول للمشغلين المبتدئين ل NanoSight LM10. باتباع التعليمات خطوة بخطوة ، يمكن الحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. تساعد هذه التقنية على ضمان نتائج متسقة عبر عمليات تشغيل تجريبية متعددة بغض النظر عن مستوى مهارة المستخدم.

لا يزال توصيف الجسيمات النانوية ، وخاصة القياس الكمي ، يمثل تحديا في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل ثابت لحجم وتركيز الجسيمات النانوية في التعليق. ابدأ بتنظيف الأسطح الزجاجية لوحدة الليزر باستخدام منظف عدسة عالي الجودة وورق عدسة.

قبل تجميع الوحدة ، تأكد من أن ختم O-ring يجلس بشكل صحيح في أخدود غطاء خلية التدفق. ثم ضع غطاء خلية التدفق على وحدة الليزر ، مما يضمن أن الاتصالات الكهربائية في الاتجاه الصحيح. بعد ذلك ، ضع مسامير الإبهام الأربعة المحملة بنابض من خلال لوحة خلية التدفق وإشراك خيوط وحدة الليزر دون تشديد بشكل فردي.

أثناء وضع ضغط موحد لأسفل على غطاء خلية التدفق ، قم بتشديد مسامير الإبهام بشكل موحد بطريقة قطرية متناوبة حتى تكون دافئة. اغسل اثنين من محاقن السل بملليلتر واحد مع محولات قفل الانزلاق ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS. قم بإزالة المكبس والتخلص منه من حقنة السل الأولى قبل إدخال المحقنة في المنفذ المتبقي لتكون بمثابة خزان مخفف أو عينة مفرغ.

ثم املأ المحقنة الثانية بملليلتر واحد من DPBS وقم بإرفاقها بمنفذ مدخل غطاء خلية التدفق. أمسك وحدة الليزر مائلة مع رفع منفذ حقنة المخرج للسماح بتطهير الهواء من الغرفة أثناء حقن DPBS ببطء في وحدة الليزر. اطرد DPBS المتبقية من وحدة الليزر عن طريق حقن ملليلتر واحد من الهواء في منفذ المدخل.

كرر التنظيف مرتين. بعد التدفق الأخير ، قم بإفراغ وحدة الليزر بالكامل قدر الإمكان وقم بتحميل الوحدة للتركيز وتحديد المواقع. افتح البرنامج.

ضمن علامة التبويب التقاط في الزاوية العلوية اليمنى، انقر فوق بدء تشغيل الكاميرا. إذا تم إيقاف تشغيل الكاميرا تلقائيا بعد خمس دقائق، فانقر فوق بدء تشغيل الكاميرا لإعادة تشغيلها. في نفس علامة التبويب، اضبط مستوى الكاميرا على 14 إلى 16 لتفتيح خط الليزر وتبسيط تحديد الجسيمات والتركيز البؤري.

من خلال تحريك شريط التمرير العلوي على الجانب الأيسر من قطعة الرأس للداخل أو للخارج، قم بتحويل الصورة من الكاميرا إلى العدسات. في مجال الرؤية، أوجد مساحة الكثافة المتزايدة، المشار إليها باسم بصمة الإبهام والوسط، وركز بصمة الإبهام عموديا. في مجال الرؤية، قم بتوسيط خط الليزر، ثم حرك شريط التمرير العلوي لتحويل الضوء إلى الكاميرا كما هو ملاحظ على شاشة الكمبيوتر.

الصورة على شاشة الكمبيوتر هي صورة طبق الأصل من العرض في عيادات المجهر. اضبط التركيز البؤري لتوضيح صورة الجسيمات المتحركة الفردية على الشاشة باستخدام مقبض التركيز البؤري. لتحميل العينات، ارسم ملليلتر واحد من العينة في حقنة درنية بالملليلتر واحد وشطف وقم بتوصيل المحقنة بمنفذ مدخل غطاء خلية التدفق.

استمر في تطوير المكبس حتى يتضح السائل في المحقنة المفتوحة المتصلة بمنفذ المخرج. يجب إمالة الوحدة للسماح بتطهير الهواء من وحدة الليزر. في طريقة عرض الكاميرا، انقل التركيز البؤري إلى يسار خط الليزر إلى منطقة بها عدد موحد من الجسيمات.

اضبط الاتجاه الرأسي لتوسيط نطاقات الضوء الأفقية وأعد التركيز البؤري حتى يظهر أكبر عدد من الجسيمات. ضمان الحفاظ على وضع التركيز متسقا لجميع التدابير اللاحقة. اضبط مستوى الكاميرا بحيث يومض رمز المعلومات المظلمة بشكل متقطع في أعلى يسار عرض الكاميرا.

لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو NTA ، اضبط المدة على 30 أو 60 ثانية وعدد مقاطع الفيديو على خمسة. لتغيير اسم الملف الأساسي الموجود، انقر فوق علامة التبويب الخاصة بموقع تخزين جديد للبيانات التي تم إنشاؤها باسم ملف جديد. ثم حدد مربع درجة الحرارة المستهدفة لإدخال درجة الحرارة المطلوبة وانقر فوق إنشاء برنامج نصي لإعادة استخدام القياس القياسي.

بمجرد تحميل العينة وتصبح التجربة جاهزة للتشغيل، انقر فوق إنشاء برنامج نصي وتشغيله. في الشاشة المنبثقة "تفاصيل تقرير المجموعة"، املأ الحقول بالمعلومات الضرورية عن المشغل والعينة والمخفف. عند ملء كافة الحقول المطلوبة، انقر فوق الإعدادات موافق لبدء البرنامج النصي.

قبل كل التقاط فيديو، ابحث عن مطالبة بالتقدم إلى المكبس يدويا. حقن ما يقرب من 0.05 ملليلتر من العينة في غرفة الليزر. عندما تستقر الجسيمات، انقر فوق موافق. عند الانتهاء من التقاط الفيديو الخامس ، سيظهر مربع تأكيد الإعدادات مع مربع العملية.

نظرا لأن الإطارات يتم تطويرها يدويا من أسفل شاشة الفيديو ، لاحظ عدد الصلبان الزرقاء التي تصنع جزيئات على الشاشة وقم بتعيين عتبة الكشف لمعالجة العينة. انتظر حتى تتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا في رسم بياني للنتائج قبل عرض إشعار مربع حوار بالاكتمال، ثم اضغط على موافق. بعد ظهور مربع إعدادات التصدير، احفظ النتائج بالنقر فوق تصدير. قم بتمييز جميع مقاطع الفيديو الخمسة التي تم التقاطها المدرجة في التجربة الحالية.

بعد ذلك ، انقر فوق معالجة الملفات المحددة وانتظر حتى يظهر مربع تأكيد الإعداد في مربع العملية للوميض لتغيير عتبة الكشف ، ثم اضبط عتبة الكشف إلى المستوى المطلوب وانتقل إلى الإعداد وانقر فوق موافق. ستتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا في رسم بياني للنتائج وسيتم عرض إشعار مربع حوار بالاكتمال. انقر OK.In التحليل التمثيلي ، ونتائج تحليل التتبع النانوي ، أو NTA ، لعينات الجسيمات الشحمية ومخفف DPBS التمثيلي. كان متوسط قطر الجسيمات في العينات المصفاة 108 نانومتر وتركيز 7.4 في 10 إلى الجسيمات الثامنة لكل ملليلتر.

وعلى النقيض من ذلك، كان متوسط قطر الجسيمات غير المصفاة 159 نانومتر وتركيز 7.6 في 10 إلى الجسيمات الثامنة لكل ملليلتر. وعلى مستويات الكاميرا مجتمعة، ومع زيادة عتبة الكشف من اثنين إلى خمسة، أظهر متوسط حجم الجسيمات وحجمها انخفاضا كبيرا في أحجام الجسيمات للعينات التي تمت تصفيتها. وانخفضت تركيزات الجسيمات عند مستويات الكاميرا مجتمعة مع زيادة عتبة الكشف.

ولم يكتشف أي فرق كبير في تركيزات الجسيمات بين العينات المصفاة وغير المصفاة. وعند عتبات الكشف مجتمعة، ومع زيادة مستوى الكاميرا من 12 إلى 14، لوحظ انخفاض في متوسط حجم الجسيمات ووضعها في العينات التي تمت تصفيتها. زادت تركيزات الجسيمات عند عتبات الكشف مجتمعة مع زيادة مستويات الكاميرا من 12 إلى 14.

ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات المصفاة وغير المصفاة. الخطوات من 4.1 إلى 5.2 مهمة للعثور على منطقة العرض الصحيحة. يعتمد تحقيق نتائج متسقة عبر عمليات تجريبية متعددة على هذه المهارة القابلة للتكرار.

غالبا ما يستخدم تشتت الضوء الديناميكي كمرافق لتحليل تتبع الجسيمات النانوية في المقام الأول للحصول على إمكانات زيتا ، وهي الشحنة السطحية للجسيمات. بالنسبة لتحليل الجسيمات النانوية ، لا يزال NTA طريقة قيمة للغاية لقياس كمية الجسيمات المفيدة لأبحاث الحويصلة خارج الخلية.