Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين

كنموذج حيواني قوي في الدراسات العصبية التنكسية والسلوكية ، يمكن استخدام C.elegans لفحص وتقييم المركبات السامة بكفاءة ضد السمية العصبية متعددة الجلوتامين باستخدام نماذج هنتنغتون الشبيهة بالأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التنميط ودمج الأنماط الظاهرية المتعددة في نماذج C.elegans المختلفة. أيضا في الواقع مثل نماذج C.elegans تستخدم في هذه الطريقة.

إنه يوفر حجما في الفحص والتحقيق في المرشحين العلاجيين للتأخيرات العصبية التنكسية الأخرى وفي الواقع التأخيرات الأخرى. يرجى الانتباه إلى درجات الحرارة المستخدمة في نمو C.elegans وإجراء الاختبار في المراحل الصحيحة من التطور الاسمي. سيظهر الإجراء جيانغ ي ، شيوا يو ، ووانغ تشيانغ تشيانغ ، ثلاثة طلاب دراسات عليا.

ابدأ بنقل 300 إلى 500 يرقات L1 متزامنة من الديدان الخيطية AM141 إلى كل بئر من صفيحة بئر 48 مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على سلالة OP50 من E.coli وخمسة ملليغرام لكل ملليلتر من استراغالان. أغلق اللوحة بالبارافيلم واحتضنها عند 20 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لفترات زمنية مطلوبة. انقل الديدان الخيطية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر واغسله بمخزن M9 المؤقت ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي لإزالة خلايا OP50 المتبقية.

ثم أعد تعليق الديدان الخيطية AM141 في المخزن المؤقت M9. الآن ، انقل 10 إلى 15 ديدان خيطية إلى كل بئر في صفيحة بئر 384 ، ووضع 10 آبار مكررة لكل معالجة وإضافة 10 ميكرولتر من 200 مللي مول من أزيد الصوديوم إلى كل بئر لشل الديدان الخيطية عن طريق السماح لها بالاستقرار في القاع. ضع اللوحة في نظام تصوير عالي المحتوى للحصول على صور فلورسنت.

افتح برنامج الحصول على الصور وقم بإعداد المعلمات المذكورة في مخطوطة النص. قم بتحليل بيانات الصورة عن طريق فتح نافذة بيانات لوحة المراجعة وتحديد لوحة الاختبار لتحليل الصور. انقر نقرا مزدوجا فوق بئر اختبار لعرض صورته.

ثم حدد نوى العد كطريقة تحليل وانقر على زر تكوين الإعدادات. حدد الصورة المصدر من قناة FITC وحدد الخوارزمية القياسية. اضبط معلمات تحليل الصور كما هو موضح في مخطوطة النص واختبرها لتحسين طريقة التحليل.

حفظ الإعدادات وتشغيل التحليل على جميع الآبار. تصدير إجمالي النوى كإجمالي عدد مجاميع Q40:YFP في كل بئر. احسب عدد الديدان الخيطية في كل بئر واحسب متوسط عدد مجاميع Q40:YFP لكل ديدان خيطية في كل مجموعة.

ثم احسب مؤشر التثبيط. لإعداد الديدان الخيطية لفحص السمية العصبية polyQ ، انقل 300 إلى 500 يرقات L1 متزامنة من الديدان الخيطية HA759 إلى كل بئر من صفيحة بئر 48 مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على سلالة OP50 من E.coli وخمسة ملليغرام لكل ملليلتر من استراغالان. بعد ختم الألواح ، قم باحتضان الديدان الخيطية وحصادها وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت M9 كما هو موضح سابقا.

الآن ، قم بالتحضير في وسادة الأغاروز عن طريق إضافة غرامين من الأغاروز إلى 100 ملليلتر من المخزن المؤقت M9 وتسخين المحلول في الميكروويف إلى ما يقرب من الغليان. قم بتوزيع 0.5 ملليلتر من الأغاروز المذاب على وسط شريحة زجاجية مجهرية بسمك ملليمتر واحد موضوعة بين قطعتين من ألواح زجاجية بسماكة مليمترين ، مغطاة بشريحة أخرى عموديا. قم بإزالة الشريحة العلوية بلطف بمجرد أن يبرد الأغاروز ويتصلب.

ابدأ اختبار البقاء على قيد الحياة العصبي ASH عن طريق إضافة قطرة من 20 ملليمولار أزيد الصوديوم على وسادة agros ثم نقل 15 إلى 20 من الديدان الخيطية HA759 إلى القطرة لشل حركتها. ضع غطاء ينزلق بلطف فوق الديدان الخيطية. الآن ، احتفظ بالشريحة تحت مجهر فلوري مزود بكاميرا رقمية.

حدد عدسة موضوعية 40x ومرشح FITC للكشف عن الخلايا العصبية ASH الإيجابية GFP في منطقة الرأس من الديدان الخيطية. حدد أكثر من 50 نيماتودا في كل مجموعة بشكل عشوائي لحساب عدد الديدان الخيطية مع الخلايا العصبية الثنائية ASH المسماة GFP في منطقة رأسها ، ثم حساب معدل بقاء الخلايا العصبية ASH. بالنسبة لفحص التجنب الأسموزي ، قسم صفيحة NGM الخالية من الطعام إلى مناطق طبيعية ومحاصرة عن طريق إنشاء خط جليسرين ثمانية مولي في المنتصف.

ثم ، انشر خط أزيد الصوديوم 200 ملليمولار على بعد حوالي سنتيمتر واحد من خط الجلسرين لشل الديدان الخيطية التي تعبر حاجز الجلسرين إلى منطقة الفخ. انقل حوالي 200 ديدان خيطية لكل منها إلى المنطقة العادية المكونة من ثلاث لوحات مكررة لكل مجموعة. ثم ، أضف قطرة من 1٪ من البيوتانيديون إلى منطقة الفخ لجذب الديدان الخيطية.

غطي غطاء طبق بتري على الفور واحتضنيه عند 23 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. سجل عدد الديدان الخيطية على كلتا المنطقتين تحت المجهر واحسب مؤشر التجنب. تعبر سلالة polyQ المعدلة وراثيا AM141 بقوة عن بروتينات الاندماج Q40: YFP في خلايا عضلات جدار الجسم ، التي تم تحديدها بواسطة بروتوكول التصوير والتحليل الآلي هذا ، والتي تم تثبيط كميتها المتزايدة عن طريق العلاج الاستراغالان مما يدل على إمكاناتها الوقائية.

يشير فقدان تألق GFP والخلايا العصبية الثنائية ASH في مناطق الرأس من الديدان الخيطية إلى موت الخلايا العصبية ASH. يمكن استخدام اختبار البقاء على قيد الحياة العصبي ASH هذا لتقييم التأثير العصبي الوقائي لمركبات الاختبار بصريا على الخلايا العصبية الأنيقة Caenorhabditis. تم استخدام اختبار التجنب الحسي الكيميائي لفحص عينات الاختبار الفعالة على الخسارة الوظيفية للخلايا العصبية ASH بوساطة تجميع polyQ.

ارتفع مؤشر تجنب الديدان الخيطية HA759 المعالجة بالاستراغالان عند 15 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام إلى أكثر من 0.6 ، مما يدل على تأثير وقائي عصبي من عديد السكاريد ضد الإعاقات السلوكية. لتقييم القدرة العصبية الإجمالية لمركبات الاختبار ، تم دمج البيانات من الفحوصات الفردية وتقديمها كمخطط رادار يوضح مساحة المثلث في مجموعة علاج استراغالان أكبر من مساحة المجموعة الضابطة ، مما يشير إلى الآثار المضادة ل polyQ من السكريات. يرجى أن تضع في اعتبارك أن الطعام ودرجة الحرارة والرطوبة قد تؤثر على سلوكهم من C.elegans.