التألق بين الأطوار في الموقع تهجين مسحات نخاع العظم من المايلوما المتعددة

إن تطبيق التهجين الفلوري في الموقع المسمى FISH على التقسيم الطبقي للمخاطر الوراثية في الورم النقوي المتعدد أمر ضروري. الجزء الحاسم من تقارير FISH ليس كل الخلايا النووية ، ولكن خلايا البلازما النسيلة التي تم تنقيتها أو تحديدها على وجه التحديد عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام كابا السيتوبلازمية أو الغلوبولين المناعي لسلسلة لامدا الخفيفة مع اختبار FISH المسمى cIg FISH. تبين أن FISH بين الأطوار بعد فرز خلايا البلازما أو cIg FISH مهم في تشخيص الورم النقوي المتعدد ، بسبب نسبة أقل نسبيا من خلايا البلازما في نخاع العظام.

ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها بعض أوجه القصور بما في ذلك العمليات المعقدة ، وارتفاع طلبات العينات وارتفاع التكاليف التجريبية. يمكن تحديد موقع خلايا البلازما بسرعة في مسحة نخاع العظم. بناء على ذلك ، نستخدم مسحة نخاع العظم FISH للكشف عن خلايا المايلوما المتعددة.

أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان. تم جمع العينات من مريض المايلوما المتعددة في قسم أمراض الدم ، مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان الصينية. ضع أول 0.2 ملليلتر من محلول نخاع العظم على شريحة زجاجية نظيفة يمكن التخلص منها ، وانشر مسحات نخاع العظم إلى سمك موحد وذيول حادة عن طريق إزالة نخاع العظم بسرعة ثم تجفيفه بشكل طبيعي.

قم بتغطية أفلام نخاع العظم بملليلتر واحد من محلول رايت جيمسا لمدة 10 ثوان تقريبا في درجة حرارة الغرفة. أضف ملليلتر واحد من العازلة للفوسفات إلى الشرائح ، وكانت هناك حاجة إلى العناية لمنع محلول الصبغة من الجفاف أو التدفق من الشرائح. امزج محلول الصبغة بلطف واحتفظ به لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

شطف الشرائح بالماء النظيف وتجفيفها في الهواء في درجة حرارة الغرفة. استخدم المجهر الضوئي الأمامي للكشف عن خلايا البلازما الخبيثة ، يجب أن تكون خلايا البلازما مشتتة جيدا. الآن ما نراه في الميدان هو خلايا البلازما المنتشرة إلى حد ما.

هذه خلية بلازما نووية ثنائية النواة نموذجية. قم بتغطية المنطقة الهجينة بمحلول مثبت لمدة 10 دقائق لتغيير لون خلايا البلازما وإصلاحها. شطف الشريحة بالماء منزوع الأيونات وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.

سخني جرة تحتوي على مخزن مؤقت SSC مرتين إلى 56 درجة مئوية في حمام مائي. اغسل مسحة نخاع العظم المحضرة في المخزن المؤقت SSC المسخن مسبقا مرتين لمدة 10 دقائق متبوعا بالغمس في الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة. تجفيف اللطاخة في تدرج الإيثانول 70٪ 85٪ و 100٪ الإيثانول لكل دقيقة واحدة.

جفف اللطاخة في الهواء لمدة 10 دقائق. أولا إضافة TP53 على سنترومير من خليط مسبار الكروموسوم 17 إلى منطقة التهجين وتغطيته بغطاء انزلاق اضغط بلطف على الملقط المدبب بدقة لإزالة فقاعات الهواء من الأسفل. قم بإغلاق جميع جوانب الغطاء بالأسمنت المطاطي لضمان ضيق جيد.

بعد تصلب الأسمنت المطاطي ، تم وضع الشريحة على تمسخ آلة FISH التلقائي عند 78 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تليها التهجين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. التقط الشريحة من آلة FISH. استخدم ملاقط مدببة دقيقة لإزالة الأسمنت المطاطي بلطف.

اغمر الشريحة مرتين SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة أو دقيقتين تقريبا لغسل الغطاء المنزلق. اغسل الشريحة في مخزن مؤقت للتسخين المسبق بمقدار 68 درجة مئوية في حمام مائي لمدة دقيقتين. اغسل الشرائح ب SSC مرتين في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

قم بإعداده مباشرة في الظلام ليجف جيدا لمدة 10 دقائق عند 10 ميكرولتر من DAPI إلى المنطقة الهجينة ، وقم بتغطيته بقسيمة غطاء. عرض الشريحة الهجينة باستخدام مرشح مناسب على مجهر التألق ، استخدم مرشح بصري فلوروفور أزرق أحادي اللون لمراقبة شدة التألق في نواة الخلية. التقط صورا لنواة الخلية ضمن مجموعة مرشحات DAPI.

تم تصنيف CEP17 مع التألق الأخضر. استخدم مرشح بصري فلوروفوري أخضر الطيف لمراقبة موقع CEP17. التقط صورة إشارات CEP17 ضمن مجموعة المرشحات الخضراء.

تم تصنيف جين TP53 مع التألق البرتقالي. استخدم مرشح بصري فلوروفور برتقالي الطيف لمراقبة TP53 ، والتقط صورة إشارات TP53 تحت المجموعة ، وادمج هذه الصور الثلاث في كامل وفحص التشوهات العددية. في خلية طبيعية بين الأطوار ، لوحظت إشارتان برتقاليتان و إشارتان خضراوان داخل نواة ذات تألق أزرق يشير إلى زوج واحد من الكروموسومات الطبيعية 17.

أظهرت النتائج مورفولوجيا وعلم الوراثة لنخاع العظم في مريض المايلوما المتعددة. أظهر الشكل (أ) أن 15٪ من خلايا البلازما في مسحة نخاع العظم قد وجد أنها تحتوي على كميات أكبر وأكثر قتامة ونووية إلى جانب كميات كبيرة من السيتوبلازم أكثر من المعتاد. أظهر الشكل B صورة ذات مقياس رمادي لممثل بواسطة خلية بلازما نواة في مسحة نخاع العظم.

أظهر الشكل C أربع إشارات برتقالية وأربع إشارات خضراء في نواة واحدة بين الأطوار لخلية البلازما مما يشير إلى أن أربع نسخ من الكروموسوم 17 كانت موضعية في نواة. ويبين الشكل دال أن كاريوجرام الكروموسوم غير الطبيعي لهذا المريض أكد وجود زوجين من الكروموسومات 17 في نواة واحدة. الحصول على مسحات نخاع العظم أسهل بكثير من عينات نخاع العظم المضادة للتخثر لأن الحصول على نخاع العظم المضاد للتخثر يتطلب إجراءات معقدة للحصول على النواة.

وفقا لذلك ، أنشأنا طريقة مقنعة لمسحة نخاع العظم FISH للكشف عن خلايا المايلوما المتعددة.