البناء اليدوي للمصفوفة الدقيقة للأنسجة باستخدام طريقة الشريط ومصفوفة ميكرو محمولة باليد

المصفوفة الدقيقة للأنسجة ، أو TMA ، هي أداة بحثية مهمة تجمع قطعا صغيرة نموذجية من الأنسجة تعرف باسم نوى الأنسجة من كتل الأنسجة المضمنة في البارافين الثابت بالفورمالين ، والتي يشار إليها باسم كتل المانحين ، في كتلة بارافين واحدة. طريقة الشريط هي طريقة بناء يدوية بالكامل تعكس عملية البناء عن طريق صب الكتلة حول النوى المستقيمة ، وبالتالي فهي متوافقة مع كتل المانحين غير المثالية وتستخدم مصفوفات الأنسجة المحمولة غير المكلفة والمتاحة على نطاق واسع. سيتم عرض سير العمل متعدد الخطوات لهذه العملية من قبل السيد لي ويسنر والدكتور براندون لارسن.

واحدة من أهم المفاهيم التي يجب تذكرها عند بناء كتل TMA هي حقيقة أن الأنسجة في كتل الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت بالفورمالين هي في الواقع هياكل ثلاثية الأبعاد. لقد طورنا رسما متحركا هنا للمساعدة في شرح هذا المفهوم. ما تراه هنا هو رسم متحرك يصور كتلة أنسجة مدمجة من البارافين مثبتة بالفورمالين تظهر الطبيعة ثلاثية الأبعاد لهذا النسيج داخل الكتلة.

يمكنك أن ترى أن الأنسجة مرئية في الجزء العلوي من الكتلة وأن هذه المنطقة كبيرة جدا. إذا تمكنا من الحصول على رؤية بالأشعة السينية ، كما كانت ، ورؤية من خلال الكتلة ، فقد نرى أن الأنسجة ليست في الواقع ذات شكل موحد أعمق داخل تلك الكتلة ، تقريبا مثل جبل جليدي في المحيط ، حيث قد لا يمثل ما تراه على السطح في الواقع ما هو أدناه. داخل كتلة الأنسجة هذه قد تكون هناك قطع أنسجة إضافية غير مرئية على السطح.

قد تكون هناك مناطق من النخر أو موت الأنسجة داخل مركز هذا النسيج أعمق إلى أسفل. يجب على أخصائي علم الأمراض في الواقع مراجعة هذا القسم ثنائي الأبعاد من الجزء العلوي من كتلة الأنسجة هذه ثم التعليق على تلك الشريحة لإظهار المناطق التي تحتوي على الأنسجة ذات الأهمية واستبعاد النخر أو أنواع الأنسجة الأخرى التي ليست ذات أهمية في الواقع. لتسهيل أخذ العينات الأساسية المناسبة للأنسجة ، يجب على أخصائي علم الأمراض القيام بثلاثة أشياء.

أولا ، باستخدام قلم تمييز الشريحة ، سيقوم أخصائي علم الأمراض بوضع علامة على الأنسجة ذات الأهمية على الشريحة بحيث يمكن تجنب الأنسجة الأخرى. ثانيا ، إذا كانت هناك مناطق داخل هذا المجال من الاهتمام يجب تجنبها ، فيمكن لأخصائي علم الأمراض استخدام نفس قلم وضع العلامات لمسح تلك المناطق التي لا ينبغي أخذ عينات منها. وأخيرا ، يفضل استخدام لون مختلف من القلم ، يجب على أخصائي علم الأمراض وضع علامة على تلك المناطق المثالية داخل منطقة الاهتمام لأخذ العينات الأساسية وبناء TMA.

من المهم أن نضع في اعتبارنا أنه عند الانتهاء من هذه العملية ، قد يتغير تكوين الأنسجة بشكل أعمق من حيث يتم الحصول على عينة أساسية وسنوضح ذلك هنا في الرسوم المتحركة ، وأن موقع النواة سيحدد تكوين تلك النواة ، والتي ستختلف حسب عمق الأنسجة وما هو موجود داخل تلك الكتلة. على سبيل المثال ، هنا النواة الأولى التي نوضحها هي التقاط جزء من الأنسجة في نصفها العلوي ولكن أعمق داخل الكتلة لم يعد هناك أي نسيج موجود من حيث يتم الحصول على هذا القلب ، لذلك تم أخذ عينات فقط من شمع البارافين. النواة الثانية التي أوضحناها هنا التقطت الأنسجة على طولها بالكامل لأن الأنسجة موجودة في جميع أنحاء عمق تلك الكتلة بالكامل في ذلك الموقع.

وقد التقطت النواة الثالثة جزءا من الأنسجة ثم التقطت جزءا من شمع البارافين في الوسط حيث لم يكن هناك نسيج موجود ثم التقطت المزيد من الأنسجة في نهايتها السفلية حيث كان هناك نسيج في الجزء السفلي من تلك الكتلة. بمجرد اكتمال مراجعة علم الأمراض ، قم بتجميع القائمة النهائية للكتل المانحة لاستخدامها في بناء TMA ، ثم قم بإنشاء خريطة TMA. خريطة TMA هي مخطط يحدد أين سيتم وضع النوى في TMA المكتمل وأقسام الأنسجة المثبتة على الشرائح المقطوعة من TMA الناتج.

لأغراض التوجيه، تأكد من أن خريطة التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) تتجنب وضع النوى في مصفوفة زوجية مثل مصفوفة ثلاثة في ثلاثة أو أربعة في أربعة وتتضمن علامة توجيه واحدة على الأقل. نظرا لأن طريقة الشريط تعكس عملية البناء عن طريق صب الشمع المنصهر حول النوى المقلوبة ، فإن هذا يتطلب إنشاء خريطة ثانية تعرف باسم خريطة البناء وهي صورة طبق الأصل لخريطة TMA. توضح خريطة البناء المكان الذي يجب وضع كل قلب فيه أثناء البناء من أجل الظهور في الموقع الصحيح في التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي المكتمل.

بمجرد إنشاء الخرائط ، قم بإعداد قالب قاعدة TMA المعدني. لتوجيه الموضع الأساسي ، استخدم شبكة متقلبة الورق يمكن التخلص منها. قم بقص الشبكة المتقلبة للورق إلى الحجم وقم بلصق قطعة من الشريط المزدوج العصا على الجزء الخلفي من الشبكة.

ضع الشبكة والشريط في الدرج المعدني وأضف قطعة ثانية من الشريط المزدوج العصا أعلى الشبكة. تراكب شريحة H & E التي تمت مراجعتها من قبل علم الأمراض على كتلة أنسجة FFPE ليتم لكمها واستخدام علامات أخصائي علم الأمراض لتحديد مكان كتلة الأنسجة التي سيتم لكمها. باستخدام لكمة أساسية يدوية محمولة باليد ، يمكن التخلص منها أو إعادة استخدامها ، قم بلكم كتلة مانح FFPE في المنطقة المناسبة.

إذا كنت تستخدم لكمة أساسية قابلة لإعادة الاستخدام ، فتأكد من تنظيفها قبل وبعد كل لكمة في الأنسجة. أخرج النواة من اللكمة الأساسية. استخدم معول إبرة لوضع النواة المقذوفة على الشعيرات المتقاطعة للشبكة المغطاة بشريط مزدوج العصا.

تأكد من وضع اللب بطريقة مقلوبة ومستقيمة بحيث يتصل طرف نسيج النواة بالشريط ويكون في الموقع الصحيح كما هو موضح في خريطة البناء. كرر ذلك حتى يتم حفر جميع الكتل المانحة ويتم وضع النوى في مواقعها المناسبة. بمجرد أن تكون جميع النوى في مكانها ، قم بوضع علامة على كاسيت بلاستيكي وضعه فوق القاعدة المعدنية التي تحتوي على النوى.

يجب ألا يتجاوز ارتفاع النوى عمق الدرج المعدني حيث سيتم إمالة النوى الطويلة أو إسقاطها عند وضع الكاسيت في مكانه. صب البارافين المذاب بلطف من خلال الكاسيت في صينية النوى. اسمح للبارافين المنصهر بالفيضان لضمان عدم وجود فقاعات هواء في جسم TMA.

تأكد من أن البارافين يملأ الجزء العلوي من الكاسيت بحيث يتم تضمين الكاسيت وربطه بإحكام بكتلة البارافين بمجرد تصلبه. اترك الكتلة تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ولا تحرك الكتلة خلال هذا الوقت. ضعي الكتلة في الثلاجة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية حتى تتصلب تماما.

بمجرد ضبطه بالكامل ، افصل القالب الأساسي المعدني بلطف وقم بإزالة الشريط المزدوج العصا من كتلة البارافين. بمجرد إنشاء التحليل الحراري الميكانيكي (TMA)، استخدم ميكروتوم لتقسيم التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMA) الجديد. بمجرد مواجهة الكتلة بشكل مناسب ، قم بجمع أقسام الأنسجة كاملة الوجه.

انقل الأقسام إلى حمام مائي تم تسخينه مسبقا وقم بتحريك أقسام الأنسجة. بمجرد أن تجف ، أرسل أقساما تمثيلية لتلطيخ H & E وأي بقع كيميائية نسيجية مناعية إضافية قد تكون مطلوبة. أرسل أقسام TMA الملطخة للمراجعة المرضية.

للتحقق من صحة TMA ، يجب على أخصائي علم الأمراض مراجعة شريحة H & E من كتلة TMA ومراجعة كل بقعة دائرية تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الأنسجة ذات الأهمية موجودة. أحد المكونات الحاسمة في عملية البناء هو تحديد الأنسجة ذات الأهمية في كتلة مانحة معينة من حيث يجب الحصول على قلب TMA. يظهر العمود الأول من هذا الشكل المتبرع المثالي H&Es مع علامات أخصائي علم الأمراض.

يظهر العمود الثاني المنطقة المثقوبة من الأنسجة الملطخة H&E. يوضح العمود الثالث الأنسجة الملطخة H&E لنوى TMA التي تم حصادها من الكتل المانحة في المناطق الموضحة في العمودين الأول والثاني. يمكن لأخصائي علم الأمراض عرض كتلة المتبرع المتطابقة و TMA الأساسية H & Es معا للتحقق من أن المنطقة ذات الاهتمام قد تم جمعها وأن تكوين الأنسجة هو نفسه.

هناك مقياسان رئيسيان لإكمال التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي بنجاح باستخدام طريقة الشريط. الأول هو وجود نقاط أساسية للأنسجة في المواقع المتوقعة والمسافة بعيدا عن بعضها البعض ، والتي يتم تقييمها عن طريق الفحص البصري. الصور المعروضة في A و B تصور اثنين من TMAs طريقة الشريط المكتملة بنجاح وشرائح H & E المقابلة.

تظهر عمليات الفحص البصري لكتل TMA هذه أن النوى موجودة ومتباعدة بانتظام في كل TMA والأقسام المقابلة لها. بعض قضايا البناء الرئيسية التي يمكن أن تنشأ أثناء عملية بناء طريقة الشريط تشمل فصل الكتلة والكاسيت بسبب الإزالة المبكرة للقاعدة المعدنية قبل التصلب ، كما هو موضح في الصورة C.Core يمكن أن يحدث إسقاط و / أو وضع النوى المدمجة كما هو موضح في الصورة D بينما يمكن أن يحدث صب مضطرب بشكل مفرط للبارافين المنصهر ، والتي قد تزداد سوءا بسبب شريط لاصق ضعيف على الوجهين. يوضح هذا الشكل أن بقعة H&E لكل من النوى هي TMA مثالية.

جميع المواقع الأساسية باستثناء واحدة موجودة في H & E. يوضح الشكل أيضا أن بعض النوى موجودة كنقاط أنسجة دائرية كاملة ، في حين أن البعض الآخر غير موجود تماما. مثل هذا الفقدان للأنسجة ليس من غير المألوف وقد يكون بسبب عدم كفاية الكتلة التي تواجه الكشف عن جميع النوى بالكامل.

بدلا من ذلك ، قد ينبع وجود الأنسجة غير المكتملة أو الغياب التام لها من سوء جودة الأنسجة في تلك النواة ، مما قد يؤدي إلى فقدان الأنسجة أثناء عملية التلطيخ. في هذا الشكل التالي ، تم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية و RNA ISH على أقسام TMA لزيادة التحقق من صحة TMA. كما هو موضح هنا ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من البقع اعتمادا على الأنسجة المستخدمة لبناء TMA.

يستخدم Vimentin كمراقبة للجودة. U6 هو مؤشر على جودة الحمض النووي الريبي. يستخدم EBER لتحديد حالة EBV.

و CD20 هو علامة الخلايا البائية للإشارة إلى وجود الخلايا البائية. هذه بعض البقع التي يمكن استخدامها للمساعدة في التحقق من صحة TMA الخاص بك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية إنشاء مصفوفة دقيقة للأنسجة باستخدام طريقة الشريط ولماذا تعد TMAs أدوات بحث مهمة لتوفير الوقت والموارد.

يجب أن تفهم أيضا أن بناء TMA ليس عملية مثالية وأن التوجيه المرضي المستمر والمراجعة هما مكونان حاسمان ليس فقط أثناء عملية البناء ولكن أيضا للدراسات الكيميائية النسيجية المناعية التي أجريت على أقسام TMA من أجل ضمان وجود الأنسجة ذات الاهتمام في الواقع في قسم TMA.