Intracerebral Transplantation and <em>In Vivo</em> Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Rebecca Z. Weber; Chantal Bodenmann; Daniela Uhr; Kathrin J. Z&#252;rcher; Debora Wanner; Melanie Generali; Roger M. Nitsch; Ruslan Rust; Christian Tackenberg

doi:10.3791/63102

زرع داخل المخ وتتبع التلألؤ الحيوي في الجسم الحي للخلايا السلفية العصبية البشرية في دماغ...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

زرع داخل المخ وتتبع التلألؤ الحيوي في الجسم الحي للخلايا السلفية العصبية البشرية في دماغ الفأر

Full Text

3,671 Views

06:12 min

January 27, 2022

DOI: 10.3791/63102-v

Rebecca Z. Weber^1,2, Chantal Bodenmann¹, Daniela Uhr¹, Kathrin J. Zürcher¹, Debora Wanner¹, Melanie Generali¹, Roger M. Nitsch¹, Ruslan Rust*^1,2, Christian Tackenberg*^1,2

¹Institute for Regenerative Medicine,University of Zurich, ²Neuroscience Center Zurich,University of Zurich and ETH Zurich

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study demonstrates the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells in the mouse brain, utilizing a dual reporter vector that expresses luciferase and green fluorescent protein (GFP). The methodology enables longitudinal in vivo imaging of the transplanted cells, providing insights into their migration and survival over time.

Key Study Components

Area of Science

Cell-based therapy
Neural regeneration
In vivo imaging

Background

Cell-based therapies are promising for brain regeneration.
Longitudinal imaging allows tracking of grafted cells.
This technique is applicable to various luciferase-expressing cell lines.
Signal strength variability is dependent on transplantation depth and luciferase expression.

Purpose of Study

To develop a protocol for tracking transplanted neural progenitor cells.
To gain insights into cell migration and survival over extended periods.
To provide a tool for studying neurological diseases.

Methods Used

Utilized in vivo imaging with bioluminescence and fluorescence microscopy.
Transplanted human neural progenitor cells into the mouse brain.
Cells were tested for successful transduction in vitro before transplantation.
Detailed surgical protocol included anesthesia, skull drilling, and cell injection.
Bioluminescence signals were measured post-transplantation for tracking.

Main Results

Successful transplantation of neural progenitor cells was confirmed via luciferase and GFP signals.
Cells showed survival for at least five weeks post-transplant.
Transduced cells were identifiable through histological analysis.
Quantitative tracking of transplanted cells was achieved, highlighting their viability.

Conclusions

The procedure enables continuous tracking of neural progenitor cells in vivo.
This protocol is applicable to various neurological disease models.
Insights from this study could enhance understanding of brain regeneration mechanisms.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this transplantation method?

The method allows for real-time monitoring of cell behavior post-transplantation, enhancing understanding of cell dynamics in the brain.

How are the human neural progenitor cells prepared for transplantation?

Cells are thawed from cryogenic storage, resuspended, and centrifuged before being injected into the brain.

What types of imaging data are obtained?

In vivo bioluminescence and fluorescence imaging provide quantitative data on cell survival and localization over time.

Can this protocol be applied to other cell lines?

Yes, the technique can be adapted for any luciferase-expressing cell line in mouse brain transplantation.

What considerations should be taken into account during the procedure?

Accurate calculation of injection coordinates is crucial to hit the target site and avoid reflux after injection.

How do the imaging techniques contribute to this research?

The imaging techniques allow researchers to visualize and quantify the fate of transplanted cells, offering insights into regenerative processes.

نحن نصف عملية زرع البطانة اللبنية للخلايا السلفية العصبية البشرية التي تم نقلها باستخدام ناقل مراسل مزدوج يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر luciferase (GFP) في دماغ الفأر. بعد الزرع ، يتم قياس إشارة luciferase بشكل متكرر باستخدام التلألؤ الحيوي في الجسم الحي والخلايا المطعمة المعبرة عن GFP المحددة في أقسام الدماغ باستخدام المجهر الفلوري.

العلاج القائم على الخلايا لديه إمكانات هائلة لتجديد الدماغ. البروتوكول الذي نوضحه هنا ذو قيمة ، لأنه يسمح بالتصوير الطولي في الجسم الحي للخلايا المزروعة في دماغ الفأر. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص لاكتساب رؤى حول هجرة وبقاء الكسب غير المشروع في نفس الحيوان على مدى فترة من الزمن.

يمكن تطبيق هذا الإجراء على أي خط خلوي يعبر عن لوسيفيراز مزروع في دماغ الفأر. ومع ذلك ، قد تختلف قوة الإشارة اعتمادا على عمق عملية الزرع أو تعبير luciferase في خط الخلية المعني. ستوضح ريبيكا ويبر الإجراء ، وهي طالبة دكتوراه ممتازة في مختبرنا.

ابدأ بجمع قارورة من الخلايا من تخزين 150 درجة مئوية تحت الصفر ونقلها إلى المختبر. انقل القارورة بسرعة إلى حمام مائي خفف من درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تذوب بلورات الجليد. ثم ، انقل القارورة إلى خزانة السلامة الأحيائية وقم بماصة المحتوى بأكمله في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر.

أضف تسعة ملليلترات من PBS المعقمة وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة السوبرناتانت عن طريق الشفط دون إزعاج الكريات وعد الخلايا قبل الدوران النهائي باستخدام عداد خلية آلي. نقل الحيوان من غرفة الحث إلى الإطار المجسم، والحفاظ على التخدير باستخدام قناع الوجه.

ضع مواد التشحيم العينية لمنع العينين من الجفاف. احلق فروة رأس الفأر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وقم بتطهير الجلد بمحلول بيتادين بنسبة 5٪ باستخدام مسحات القطن. قم بتأمين رأس الماوس وأدخل قضبان الأذن في الصماخ الخارجي.

حفر حفرة بقطر 2 إلى ثلاثة ملليمترات من خلال الجمجمة باستخدام مثقاب أسنان جراحي. أعد تعليق الخلايا المحضرة في الأنبوب واسحب ميكرولترين من تعليق الخلايا في حقنة. ضع المحقنة فوق الموقع المستهدف وحرك الإبرة ببطء إلى سطح الجافية واحسب إحداثيات العمق.

انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج Living Image وحدد معرف مستخدم من القائمة المنسدلة. ثم انقر فوق تهيئة في لوحة التحكم التي تظهر. في برنامج Living Image، حدد المربعين Luminescent و Photo (صورة فوتوغرافية) في لوحة التحكم وحدد التعريض الضوئي التلقائي.

حدد مجال عرض. أدخل ارتفاع الهدف وحدد خيار استخدام التركيز البؤري لارتفاع الهدف. قم بتعيين معلمات التصفية يدويا بما في ذلك الربط الكبير و F/Stop ومرشح الإثارة المحظور ومرشح الانبعاثات المفتوح.

حقن لوسيفيرين داخل الصفاق ، وبعد خمس دقائق ، تخدير الحيوانات مع إمدادات مستمرة من الأيزوفلوران. حلق الحيوانات المخدرة على منطقة الرأس باستخدام ماكينة حلاقة الشعر التقليدية. ضع الحيوان في غرفة التصوير وابدأ التصوير بعد 15 دقيقة من حقن لوسيفيرين بالنقر فوق اكتساب في لوحة التحكم.

قبل زرع الخلايا السلفية العصبية في دماغ الفأر ، تم اختبار الخلايا للنقل الناجح عن طريق التعبير عن EGFP في المختبر. تم تأكيد عملية الزرع الناجحة من خلال وجود إشارة luciferase اليراع الحمراء. بعد زرع 6،000 إلى 180،000 خلية في القشرة الحركية الحسية اليمنى للفأر ، كانت إشارة التلألؤ الحيوي قابلة للكشف في جميع التركيزات.

نجت الخلايا لمدة خمسة أسابيع على الأقل بعد الزرع. تم اكتشاف الخلايا المزروعة بنجاح خارج الجسم الحي في تحليل نسيجي لاحق من خلال مراسل EGFP والتلطيخ المناعي بالنوى المضادة للإنسان. من المهم جدا حساب إحداثيات الحقن بعناية لتجنب فقدان الموقع المستهدف.

وأيضا ، اترك المحقنة في مكانها لمدة خمس دقائق على الأقل بعد الزرع لتجنب أي ارتجاع. بعد التصوير الحيوي في الجسم الحي ، يمكن إعداد أنسجة المخ إما للتحليل النسيجي ، أو يمكن عزل الخلايا المزروعة باستخدام FACS وتتميز بتقنيات مختلفة أو مختلطة. بشكل عام ، توفر هذه التقنية تتبعا كميا ومستمرا للخلايا المزروعة في الدماغ ، ويمكن تطبيقها على عدد كبير من الأمراض العصبية بما في ذلك السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضحية.