تصوير 3D لمصفوفة الكبد خارج الخلية في نموذج فأر لالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي

NASH هو واحد من أهم أمراض الكبد المزمنة في العالم. يمكن أن يتطور إلى التليف وتليف الكبد وفي النهاية سرطان الكبد. دراسة التغيير الديناميكي ل ECM في NASH يمكن أن تساعد على فهم التليف بشكل أفضل.

التقليدية للتصوير لا يمكن أن تظهر تغييرات هيكل 3D ECM ، مما يحد من فهم عملية إعادة عرض ECM الديناميكية في تليف الكبد. للبدء ، قم بوزن الماوس قبل الإجراء. بعد تخدير الفأر حلق المنطقة البطنية باستخدام ماكينة قص الشعر وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ضع الماوس على ظهره وشل حركة الساقين على اللوحة الجراحية بشريط. استخدم مقص Mayo وملقط Adson لعمل شق بطول ثلاثة سنتيمترات بشكل جانبي في أسفل البطن. ثم شق خمسة سنتيمترات عموديا من أسفل البطن إلى عملية الخنجري دون فتح تجويف الصدر.

بعد فتح الصفاق ، ضع الأمعاء برفق على يسار الحيوان وارفع الفص الأيمن من الكبد باستخدام قضيب برأس من الحرير الصناعي لفضح الوريد البابي. لقسطرة الوريد البابي ، قم بتحفيز قسطرة وريدية قياس 24 في الطرف البعيد من الوريد البابي. ضع طرف القسطرة قبل أن يتفرع الوريد البابي إلى الفص الكبدي.

اسحب الإبرة فورا عندما تدخل القسطرة الوريد. تأكد من وضع القسطرة بشكل صحيح داخل الوريد عن طريق تعطير الكبد باستخدام PBS باستخدام حقنة ملليلتر واحدة عبر القسطرة. استخدم ملقط Dumont الدقيق ، وإبرة Castroviejo الدقيقة ، وخياطة 4-0 لوضع غرزة أسفل تفرع الوريد البابي وغرزة ثانية على بعد سنتيمتر واحد أدناه لتأمين القسطرة.

قم بتوصيل القسطرة بأنبوب سيليكون بطول متر واحد وقطر داخلي ثلاثة ملليمترات وقطر خارجي 4.1 ملم باستخدام موصل إغراء. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بمضخة تمعجية وخزان يحتوي على ماء منزوع الأيونات. قم بإزالة فقاعات الهواء داخل الأنبوب بعناية وتجنب توليد فقاعات جديدة أثناء التروية.

اضبط المضخة التمعجية على خرج تدفق يبلغ 0.2 ملليلتر في الدقيقة. اطلع أولا على الماء منزوع الأيونات لمدة ساعتين وسيتغير لون الكبد من الأحمر إلى الأصفر أثناء التروية. قم بتبديل محلول التروية إلى 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم واستمر طوال الليل وسيصبح الكبد أبيض في نهاية التروية.

قم بتبديل محلول التروية إلى ماء منزوع الأيونات و perfuse لمدة ساعتين. استخدم ملقط Dumont الصغير ومقص النوابض الدقيقة لجمع الكبد منزوع الخلايا وغسله بعناية في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. انقل قطعة صغيرة من الكبد منزوع الخلايا إلى شريحة مجهرية وضع الأنسجة في المنتصف.

أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للتلاشي إلى الأنسجة باستخدام ماصة لتجنب تجفيف الأنسجة. قم بتغطية المنديل بغطاء زجاجي واستخدم قوة صغيرة لتسطيح العينة. ختم حواف زجاج الغطاء بطلاء أظافر عديم اللون وشفاف.

ضع قطرة من زيت الغمر أعلى زجاج الغطاء وضع الشريحة على حامل شريحة المجهر. اخفض العدسة الموضوعية للزيت 20X حتى تلامس زيت الغمر. قم بالتبديل إلى القناة البنفسجية ذات الطول الموجي 405 نانومتر.

قم بتشغيل الغالق وتركيز العينة. التنقل وتحديد موضع منطقة الاهتمام للتصوير. قم بإيقاف تشغيل الغالق قبل الانتقال إلى التقاط الصور باستخدام ضوء الليزر.

لبدء تشغيل ليزر الفوتونين ، قم بالتبديل إلى عنصر تحكم الكمبيوتر وقم بتشغيل ليزر الفوتون أولا. ثم قم بتشغيل وحدة التحكم بالليزر الفوتون والمصراع لضمان أن طاقة الإخراج أعلى من 2.5 واط. تقليل طاقة الليزر لمنع التبريد الفلوري.

حدد واضبط أجهزة الكشف عن كل من مضاعفات الصور والهجين لاستيعاب الفلوروفورات المختارة. اختر عمليات الاستحواذ على الصور المتزامنة أو المتسلسلة. اضبط الثقب على أعلى قيمة.

اضبط الأطوال الموجية لليزر ، والكسب ، والطاقة ، وتعويض وقت بقاء البكسل ، ومتوسط حجم البكسل ، والتكبير. قم بتمرير وحدة تحكم الكمبيوتر Z وقم بتعيين أبعاد Z. حدد نقطتي البداية والنهاية واختر عدد الصور المعطاة داخل وحدة التخزين.

الحصول على الصور. بعد إجراء المجهر الفوتوني ، كشفت ألياف الكولاجين بدون إزالة الخلايا عن صورة منخفضة الدقة لشبكة الكولاجين. في المصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا ، لوحظت اختلافات واضحة في التشكل والتوزيع المكاني بين كبد حمية الطعام والوجبات السريعة.

أظهرت ألياف الكولاجين والفئران في نظام غذائي تشاو شبكة متشابكة ومنظمة تنظيما جيدا ، في حين أظهرت الفئران التي تتبع نظاما غذائيا للوجبات السريعة حزم كولاجين ذات اتصال أقل. يظهر الهيكل ثلاثي الأبعاد لمصفوفة الكبد خارج الخلية أن ألياف الكولاجين في الفئران على حمية تشاو أظهرت شبكة جيدة التنظيم ، ولكن ليس في فئران الوجبات السريعة. لتأكيد جودة الكولاجين الليفي في المصفوفة خارج الخلية المنزوعة الخلايا ، كانت الشرائح ملطخة بالهيماتوكسيلين Eosin وأحمر Picrosirius.

يوضح الهيماتوكسيلين والإيوسين أن جميع الخلايا قد أزيلت. في صور تلطيخ Picrosirius الأحمر ، كشفت المصفوفة خارج الخلية من الفئران التي تتغذى على تشاو عن شبكة جيدة التنظيم. وعلى النقيض من ذلك ، أظهرت الفئران على نظام غذائي للوجبات السريعة ألياف الكولاجين أكثر كثافة.

قم بإزالة الفقاعة الموجودة داخل الأنبوب بعناية قبل التروية. سوف تسد الفقاعة الوعاء في الكبد وتؤثر على التروية.