تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية
November 8th, 2021
تشير هذه الدراسة إلى نهج جديد لقياس المعلمات الوظيفية المتعددة للميتوكوندريا استنادا إلى قياس التدفق الخلوي والتلطيخ المزدوج باستخدام اثنين من المراسلين الفلوريين أو الأجسام المضادة للكشف عن التغيرات في حجم الميتوكوندريا ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتكوين سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، والحمض النووي للميتوكوندريا.
يوفر بروتوكولنا للعالم أداة قوية للزواج من معلمات دقيقة متعددة على مستوى خلية واحدة من IPS البشري ومشتقاته العصبية والواضحة. تسمح هذه البروتوكولات بمرح معلمات الميتوكوندريا ، سواء على المستوى الكلي أو المستوى المحدد لكل حجم ميتوكوندريا ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمكن تطبيق هذه التقنية على عدة أنواع من الخلايا بما في ذلك تلك الناتجة عن الأمراض العصبية التنكسية الأخرى.
لذلك ، يمكن أن يساعد في توفير نظرة ثاقبة على الآليات الكامنة وراء هذه الأنواع من الأمراض وأيضا يحتمل أن يساعد في الفحص العلاجي. للبدء ، قم بزرع الخلايا بشكل منفصل في أربعة آبار في صفيحة من ستة آبار واحتضن الخلايا حتى يتم تحقيق التقاء بنسبة 50 إلى 60٪. في نهاية فترة الاستزراع ، قم بإعداد خمسة حلول تلطيخ فردية تحتوي على مجموعات مختلفة من وسط الثقافة ، FCCP ، TMRE ، MTG ، و MITO جورب الانتشار.
أضفها إلى الآبار المعنية، واحتضن الخلايا كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، استنشق الوسط من جميع الآبار واغسله باستخدام PBS. لانفصال الخلايا ، احتضن الخلايا بملليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
تحييد كاشف تفكك الخلية مع ملليلتر واحد من DMEM ، مع استكمال 10 ٪ FBS. ثم جمع محتوى البئر في أنبوب وقائع 15 ملليلتر. قم بتكوير الخلايا عن طريق التركيز وغسل حبيبات الخلية باستخدام PBS مرة أو مرتين.
استنشق كل السوبرناتانت ، تاركا ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنبوب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS. بعد نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر ، احتفظ بالأنبوب في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
قم بتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي باستخدام إعدادات مرشح تمرير النطاق الموضحة في مخطوطة النص. افصل ما يقرب من 1 مليون خلية باستخدام كاشف تفكك الخلايا وقم بتكسير الخلايا كما هو موضح سابقا. قم بتحييد تعليق الخلية باستخدام DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS وجمع التعليق في أنبوب 15 ملليلتر.
إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 1.6 ٪ paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تخلل الخلايا مع ملليلتر واحد من الثلج البارد 90٪ الميثانول عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بحظر العينات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت المانع ، واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS ، كما هو موضح.
للكشف عن مجمعات الميتوكوندريا المختلفة والوحدات الفرعية ، احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة الموضحة في مخطوطة النص. بعد غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، احتضن الخلايا بجسم مضاد ثانوي لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا و PBS وأعد تعليقها كما هو موضح.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر ، محفوظ في الظلام على الجليد. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي واكتشاف الإشارات وتصفية واحدة باستخدام مرشح تمرير النطاق 5 30/30. لكل مجموعة فرعية من الخلايا ، حدد مخططا بيانيا وقم بتحليل متوسط كثافة التألق أو MFI لقنوات التصفية المختلفة.
احسب مستويات TMRE ، والقيم المحددة للوحدة الفرعية المعقدة MMP ROS و TFAM ، كما هو موضح في مخطوطة النص. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والخلايا الحية للتحقيق في حجم الميتوكوندريا MMP ومستويات ROS. في الخلايا العصبية POLG DA ، لوحظ انخفاض MMP محدد و ROS محدد أعلى ، في حين لم تحدث تغييرات في حجم الميتوكوندريا ، وإجمالي MMP و ROS.
انخفضت الخلايا النجمية POLG MMP ، ولكن لم يحدث أي تغيير في حجم الميتوكوندريا و ROS. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والخلايا الثابتة للتحقيق في مستوى الوحدة الفرعية المعقدة MRC و TFAM. أظهرت الخلايا العصبية DA زيادة معقدة واحدة و TFAM مقابل السيطرة ، ولكن لا يوجد تغيير في المستوى الثاني المعقد.
أظهرت الخلايا النجمية POLG انخفاضا في مجمع واحد أربعة و TFAM محددة. نظرا لأن كثافة الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على MMP والعلاقة بين MTG و MMP الفلورية ، فهذا خاص بالخلية. من المرجح أن يتطلب تكييف هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا الأخرى التحسين بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء ASIS القائم على المجهر ، على سبيل المثال ، المجهر البؤري ، مما يوفر تفاصيل إضافية عن هياكل الميتوكوندريا.
لذلك ، في حين أن هذه الاستراتيجية تكتشف خلل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية DA والخلايا النجمية من مرض الميتوكوندريا المعروف ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنيات لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في أي نوع من الخلايا والأمراض.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم المعايير الوظيفية للميتوكوندريا في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPS) ومشتقاتها العصبية. وتسمح باكتشاف التغيرات في جهد غشاء الميتوكوندريا، ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية، وتكوين سلسلة التنفس الميتوكوندريا، مما يساهم في فهم خلل وظيفة الميتوكوندريا في الأمراض التنكسية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- وظيفة الميتوكوندريا
الخلفية
- يرتبط خلل وظيفة الميتوكوندريا بالأمراض التنكسية العصبية.
- تبحث هذه الدراسة في معايير الميتوكوندريا على مستوى الخلية الواحدة.
- تهدف المنهجية إلى توفير رؤى حول آليات المرض.
- يمكن أن يساعد تقييم صحة الميتوكوندريا في الفحص العلاجي.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة لقياس معايير الميتوكوندريا في الخلايا الفردية.
- لفهم أدوار الميتوكوندريا في تنكس الخلايا العصبية والعلاجات المحتملة.
- لتحسين اكتشاف خلل وظيفة الميتوكوندريا في أنواع خلايا مختلفة.
الطرق المستخدمة
- المنصة المستخدمة هي قياس التدفق الخلوي.
- تم تحليل الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (iPS) ومشتقاتها العصبية.
- تضمنت الإجراءات الرئيسية زراعة الخلايا، التلوين المزدوج بمراسلات فلورية محددة، وتسمية الأجسام المضادة لتحليل الميتوكوندريا.
- شملت علاجات الخلايا الفصل، التثبيت، والنفاذية، يليها قياس الفلوريسنس.
- تم ذكر تكيفات البروتوكول الخاصة بنوع الخلية.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة اختلافات كبيرة في جهد غشاء الميتوكوندريا (MMP) ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا العصبية والأرومات الدبقية في نموذج POLG.
- تمت ملاحظة زيادة في معقد الميتوكوندريا ومستويات TFAM في الخلايا العصبية DA، مما يسلط الضوء على التكيفات الميتوكوندريا الفريدة.
- تشير النتائج إلى أن الخصائص الخلوية المحددة تؤثر على قياسات وظيفة الميتوكوندريا.
- إمكانية تطبيقات أوسع لأنواع خلايا مختلفة في استكشاف وظائف الميتوكوندريا والأمراض ذات الصلة.
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة نهجًا قويًا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في نماذج الأمراض التنكسية العصبية.
- تُمكّن النتائج من استكشاف إضافي لأدوار الميتوكوندريا في صحة الخلية والمرض.
- يمكن لهذه المنهجية أن تؤدي إلى فهم أفضل واستراتيجيات علاجية للأمراض المرتبطة بخلل وظيفة الميتوكوندريا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
