أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي لتحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات تروبوميوسين كيناز B المجمدة

يقدم هذا العمودي خطوات مهمة في تجميع أعمدة كروماتوغرافيا تقارب غشاء الخلية مع مستقبلات وظيفية عبر الغشاء. يمكن استخدام هذه الأعمدة لتحديد الجزيئات الصغيرة الموجودة في المستخلصات المعقدة والتفاعل مع المستقبلات عبر الغشاء المجمدة. تسرع أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي من تحديد المركبات النشطة بيولوجيا الموجودة في المخاليط المعقدة.

يمكن أن يكون استخدام أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي ذا أهمية خاصة للمهتمين بتحديد المركبات النشطة دوائيا الموجودة في المصفوفات الطبيعية المعقدة ، مثل المستخلصات النباتية أو الفطرية أو البكتيرية. للبدء ، قم بإعداد محلول مخزون البنزاميدين 200 ملليمولار عن طريق إذابة 120 من البنزاميدين في خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تحضير محلول مخزون PMSF 10 ملليمولار عن طريق إذابة 0.017 جرام من PMSF في 10 ملليلتر من الإيثانول في غطاء الدخان.

قم بإعداد كوكتيل مثبط البروتياز 100X عن طريق إذابة خليط مثبطات الأنزيم البروتيني المتوفر تجاريا في ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تخلط جيدا و aliquot 200 إلى 300 ميكرولتر من الكوكتيل. تحضير محلول مخزون ATP 100 ملليمولار عن طريق إذابة 55.114 ملليغرام من هيدرات ملح الصوديوم ATP في ملليلتر واحد من الماء المتأين فائق النقاء.

تخلط جيدا و aliquot 100 ميكرولتر من الخليط. تحضير المخزن المؤقت عن طريق إذابة 3.03 غرام من Tris-HCL ، و 2.9 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 0.22 غرام من كلوريد الكالسيوم اللامائي ، و 0.2 غرام من سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، و 0.19 غرام من كلوريد البوتاسيوم في 500 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. قم بإعداد مخزن مؤقت للتجانس عن طريق خلط 17.3 ملليلتر من المخزن المؤقت Tris مع 0.3 ملليلتر من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.2 ملليلتر من محلول مخزون PMSF ، و 0.2 ملليلتر من كوكتيل مثبطات البروتياز ، و 20 ميكرولتر من محلول مخزون ATP ، وملليلتر من الجلسرين ، و 0.029 جرام من EDTA.

اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك. قم بتدوير الخلايا التي يتم حصادها عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق عند 400 × g وقم بإزالة supernatant وغسل حبيبات الخلايا المتبقية ب 10 ملليلتر من 1X pH 7.4 PBS الجليدي البارد. تخلص من supernatant وأضف 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس.

ضع الأنبوب المخروطي على الثلج. انقل المعلق الخلوي إلى مطحنة أنسجة مجانسة Dounce سعة 40 ملليلتر ، وقم بتجانس التعليق يدويا على الجليد باستخدام 40 ضربة مدقة لأعلى ولأسفل. نقل تعليق الخلية المتجانسة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، والتخلص من الكريات ونقل supernatant إلى أنبوب مخروطي جديد.

حفظ بيليه غشاء الخلية والتخلص من supernatant. تحضير المخزن المؤقت للذوبان عن طريق خلط 8.7 ملليلتر من المحلول العازل مع 0.1 ملليلتر من محلول مخزون PMSF ، و 0.15 ملليلتر من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.1 ملليلتر من كوكتيل مثبطات البروتياز ، و 10 ميكرولتر من محلول مخزون ATP ، و ملليلتر واحد من الجلسرين ، و 0.2 جرام من كولات الصوديوم. انقل المخزن المؤقت للذوبان إلى الأنبوب المخروطي مع شظايا غشاء الخلية.

وإعادة تعليق الكرية. قم بتدوير الخليط الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة. بعد 18 ساعة ، قم بالطرد المركزي لخليط الذوبان عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 47،900 × جم.

أضف 100 ملليغرام من IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 إلى supernatant وتدوير خليط التعليق الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تحضير الغسيل العازل في أربعة لترات من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء عن طريق إضافة 24 غراما من Tris-HCl ، و 23.4 غراما من كلوريد الصوديوم ، و 0.06 غراما من كلوريد الكالسيوم ، و 5.85 غراما من EDTA ، و 0.07 غراما من PMSF.

قم بإذابة PMSF أولا في كمية صغيرة من الإيثانول ثم أضفها ببطء إلى الكأس باستخدام المخزن المؤقت. قطع 10 سنتيمترات من أنابيب غسيل الكلى غشاء السليلوز لإعداد أنبوب غسيل الكلى، ونقل التعليق الذي يحتوي على IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 وشظايا غشاء الخلية في أنبوب غسيل الكلى.

أغلق طرفي أنبوب غسيل الكلى بمشابك أنابيب غسيل الكلى. ضع أنبوب غسيل الكلى في المخزن المؤقت لغسيل الكلى. بعد 24 ساعة، ضع أنبوب غسيل الكلى في المخزن المؤقت لغسيل الكلى المعد حديثا واستمر غسيل الكلى لمدة 24 ساعة أخرى.

قم بإعداد 10 ملليمولار من الأس الهيدروجيني 7.4 خلات الأمونيوم العازلة التي سيتم استخدامها لغسل IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 وفي تجارب توصيف العمود عن طريق إذابة 0.778 جرام من خلات الأمونيوم في لتر واحد من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. بعد 48 ساعة من غسيل الكلى، قم بإزالة أنبوب غسيل الكلى من المخزن المؤقت لغسيل الكلى ونقل محتوى أنبوب غسيل الكلى إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

تخلص من السوبرناتانت واغسل الكريات المتبقية ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الكريات المتبقية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. امزجه جيدا واستخدم الملاط الناتج لتعبئة العمود الزجاجي 5 × 20 لإنتاج عمود كروماتوغرافيا CMAC.

لتعبئة العمود ، ضع مرشحا سفليا منقوعا مسبقا بمخزن مؤقت من خلات الأمونيوم في حامل الفلتر. قم بتركيب حامل المرشح في العمود الزجاجي وقم بتثبيت غطاء العمود لتأمين موضع الحامل. ضع العمود عموديا في مشبك إصبع وقم بتثبيته في حامل المختبر.

ضع دورقا أسفل العمود ، وانقل كمية صغيرة من الملاط إلى العمود الزجاجي ببطء باستخدام ماصة أحادية القناة تمسك طرف الماصة بجدار العمود الزجاجي. لتسريع عملية التعبئة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من فوق السرير الثابت باستخدام ماصة دقيقة بين كل خطوة. ضع مرشحا علويا وقم بربط وحدة المحول بحيث لا يوجد مخزن مؤقت متبقي فوق المرحلة الثابتة.

قم بتأمين موضع وحدة المحول باستخدام قفل المحول. قم بتوصيل العمود بمضخة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، ولغسل العمود بين عشية وضحاها باستخدام مخزن خلات الأمونيوم ، اضبط معدل التدفق على 0.2 ملليلتر في الدقيقة. للتخزين لفترة أطول ، قم بتشغيل العمود بمحلول أزيد الصوديوم بنسبة 0.05٪ في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، وارتداء معطف المختبر ، ونظارات السلامة ، والقفازات عند العمل مع أزيد الصوديوم وتخزينها عند أربع درجات مئوية.

كمبيوتر شخصي. أدت جسيمات DD2 مع شظايا غشاء خلية الورم الأرومي العصبي TrkB المجمدة وفي وجود BDNF إلى جزيئات فلورسنت. لم يلاحظ أي تألق في جسيمات IAM المغلفة بغشاء الخلية الخالية من TrkB أو عندما لم يتم استخدام BDNF كما هو الحال في جسيمات IAM المغلفة بغشاء خلية TrkB. تظهر أعمدة CMAC الوظيفية كروماتوجرام التقارب الجبهي النموذجي لزيادة تركيزات 7 و 8-DHF من ملليمولار واحد و 750 نانومولار و 500 نانومول و 300 نانومولار إلى مستقبلات TrkB المجمدة ، والتي أظهرت تغيرا يعتمد على التركيز في وقت الاستبقاء.

أظهر عمود CMAC غير وظيفي عدم وجود تغييرات تعتمد على التركيز في الاحتفاظ برباط العلامة. تم إعداد عمود التحكم السلبي CMAC عن طريق شل شظايا غشاء الخلية ، وليس التعبير عن البروتين المستهدف لاستبعاد التفاعلات غير المحددة. أدت إضافة مستخلص غوتو كولا المائي بنسبة 0.2٪ إلى انخفاض كبير قدره 7،8-DHF الاحتفاظ ، مما يشير إلى وجود روابط متنافسة لموقع ربط ناهض.

كما أن عدم وجود تخفيض للاحتفاظ ب 7 ، 8-DHF على عمود TrkB السلبي CMAC ، أكد أيضا عدم وجود مستقبلات TrkB وظيفية في هذا العمود. حدد نهج كروماتوغرافيا الذروة المفقود مركبا تم الاحتفاظ به بقوة على عمود TrkB ، بينما كان يتخلى مبكرا عن عمود TrkB الفارغ ، مما يشير إلى تفاعل محدد. من الأهمية بمكان معرفة مصدر المستقبلات الخاصة بك لعمود كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي السريع.

تأكد من التحقق من الأدبيات لتصميم المخازن المؤقتة للتجانس والذوبان بشكل صحيح. تم استخدام عمود كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي المعد في هذا البروتوكول لتحديد الضربات الدوائية المحتملة الجديدة وتوصيف طبيعة التفاعل بين المستقبلات المجمدة وروابطها الطبيعية.